Rotation entraînée par l’hydrolyse de l’ATP

Le cycle rotatif hydrolytique est composé de trois étapes de 120o dans le domaine catalytique F1 de l’enzyme, défini dans les expériences de rotation biophysique par des « habitations catalytiques”. Chaque étape de 120o est divisée en sous-étapes définies par une pause catalytique après chaque étape de 120o, avec une pause intermédiaire de « liaison à l’ATP” à 30o et une pause de « libération de phosphate” à 95o. La libération de phosphate permet à l’enzyme de terminer l’étape 120o et d’arriver à la phase de liaison à l’ATP. Nous avons décrit les structures du domaine catalytique F1 au niveau de la libération de phosphate et des séjours catalytiques, et avons montré que la sous-étape rotative 35o entre la libération de phosphate et les séjours catalytiques dépend de la libération de phosphate à partir de la pause « liaison ATP”, qui permet ensuite à l’enzyme de passer à la « pause catalytique”. Le séjour catalytique lui-même représente une transition où une molécule d’ATP liée devient prête pour l’hydrolyse. Nos efforts actuels sont centrés sur la définition du séjour catalytique dans l’encéphalopathie F1-ATPase.

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Génération de film de rotation 30o de la sous-unité γ dans l’encéphalopathie F1-ATPase par la libération de phosphate de la sous-unité ßE. Le film commence par une vue du côté de F1-ThioP en représentation de ruban, avec le thiophosphate lié en tant que sphères orange. Les sous-unités α et β sont respectivement rouges et jaunes. Ensuite, les sous-unités aTP-, aDP-, ßTP- et ßDP- sont éliminées séquentiellement en laissant le dimère aEßE et les sous-unités de tige centrale γ, δ et ε (respectivement bleu, magenta et vert). Ce sous-complexe résiduel est tourné vers la droite autour de l’axe des ordonnées de 100° pour exposer une vue de côté de la sous-unité aE et de la tige centrale. Ensuite, les sous-unités δ et ε et les résidus γ-42-210 sont éliminés et la sous-unité ßE s’affaiblit. Dans les trames finales, le phosphate lié est libéré et la sous-unité aE s’ouvre et s’éloigne de la sous-unité γ, perturbant les interactions d’emballage entre les sous-unités aE et γ. Afin de rétablir ces interactions, la sous-unité γ tourne de 30°. La structure de l’état final est l’état de libération post-phosphate de la F1-ATPase bovine trouvée dans le F1-I3-ThioP.

Rotation entraînée par le pmf

La donnée manquante clé pour comprendre la génération de rotation à partir du pmf est la structure détaillée au niveau atomique de la voie empruntée par les protons à travers le domaine membranaire de l’enzyme. La meilleure structure disponible à ce jour est celle que nous avons déterminée à une résolution de 4 Å en 2015 par cristallographie aux rayons X du complexe enzymatique de Paracoccus denitrificans. D’autres ont été déterminées en 2015 et 2016 par cryo-microscopie électronique de particules uniques des enzymes bovines et fongiques, au mieux à une résolution de 6 Å. Cependant, ces modèles manquent tous des détails nécessaires à la formulation d’un mécanisme moléculaire de génération de rotation à partir de la force motrice du proton et, en raison de la motilité et de la flexibilité des enzymes, des particules uniques de l’enzyme peuvent adopter de nombreuses positions différentes. Par conséquent, il présente un problème inhabituellement difficile pour l’approche cryo-em.

Figure le domaine membranaire de la F-ATPase de P. angusta. En A-D, la sous-unité a est bleu fleur de maïs. A et B, vues en représentation solide de côté et sous le domaine membranaire. L’anneau c10 est gris, la sous-unité b (partie supérieure non représentée) est rose et les segments jaune pâle, rouge brique, cyan clair et beige sont des hélices α transmembranaires, Ch1-Ch4 assignées aux sous-unités f, ATP8, aH1 et bH1, respectivement. Dans l’anneau c, I-IV indiquent les quatre hélices α transmembranaires C-terminales en contact avec les sous-unités a.C et D, vues de la sous-unité a en représentation solide et en dessin animé vues de l’extérieur et regardant de l’interface avec l’anneau c, respectivement, avec aH1 en cyan pâle. Les résidus polaires conservés sont jaunes, les positions des mutations humaines associées à des pathologies (voir Tableau S1) sont rouges. La sphère rose désigne l’Arg-179 conservé dans aH5 qui est essentiel pour la translocation des protons. La flèche inférieure indique la voie d’entrée des protons qui se transfèrent vers Glu-59 dans l’hélice α-II terminale C du cycle c. Ils sont transportés autour de l’anneau par rotation dans le sens inverse des aiguilles d’une montre vue de dessus, jusqu’à ce qu’ils arrivent à Arg-179 où ils entrent dans la voie de sortie, indiquée par la flèche supérieure.

Structures des ATP synthases bactériennes

Figure les ATP synthases bactériennes. (A) F1-ATPase de Caldalkalibacillus thermarum à une résolution de 2,6 Å par cristallographie aux rayons X; (B) Enzyme ATP synthase de Paracoccus denitrificans à une résolution de 4 Å par cristallographie aux rayons X; (C) ATP synthase d’Escherichia coli à une résolution de 7 Å par cryo-EM.

Par rapport aux études approfondies que nous avons menées sur les enzymes mitochondriales, les structures des ATP synthases bactériennes ont été peu étudiées, à l’exception des structures des domaines catalytiques F1 des enzymes d’Escherichia coli et de Geobacillus stearothermophilus (anciennement Bacillus stearothermophilus) à une résolution de 3,2 et 3,9 Å respectivement, et des structures des cycles c de leurs domaines membranaires de diverses espèces. Afin de combler cette lacune, nous avons jusqu’à présent contribué à la structure de l’enzyme entière de Paracoccus denitrificans à une résolution de 4 Å et, en collaboration avec le professeur G. M. Cook et ses collègues de Dunedin, en Nouvelle-Zélande, aux structures des domaines catalytiques F1 des ATP synthases de Caldalkalibacillus thermarum, Fusobacterium nucleatum et Mycobacterium smegmatis. C. thermarum est un thermoalcaliphile, et la structure de son domaine catalytique à une résolution de 2,6 Å est la structure la plus précise d’une F1-ATPase bactérienne encore déterminée. L’enzyme de M. smegmatis est étroitement lié à l’enzyme de M. tuberculosis. La structure de son domaine catalytique a été déterminée à une résolution de 4 Å et constitue une cible pour le développement de nouveaux médicaments antituberculeux. L’agent pathogène parodontal opportuniste, Fusobacterium nucleatum, est associé à un large éventail de maladies, y compris les infections buccales, les résultats avancés de la grossesse, les maladies gastro-intestinales et l’athérosclérose. En outre, il a été lié au développement et à la progression du cancer colorectal par l’inhibition des voies de signalisation immunitaires anti-tumorales et la promotion ultérieure de la chimiorésistance. C’est un anaérobe obligatoire et couple l’énergie libre de décarboxylation du glutaconyl-CoA en crotonyl-CoA au transport des ions Na + à travers sa membrane cellulaire pour générer une force motrice des ions sodium (smf). L’ATP synthase utilise le smf pour piloter la synthèse de l’ATP requise pour les réactions cataboliques et anaboliques. La structure de son domaine catalytique F1 a été déterminée à une résolution de 3,6 Å. En utilisant cryo-EM, une carte de l’ATP synthase intacte d’E. coli a été publiée montrant la sous-unité ε en position « up” (voir ci-dessous), et récemment, une structure de l’ATP synthase de Geobacillus stearothermophilus a été déterminée à 3 Å.

Structure des ATP synthases parasites

Figure La F1-ATPase de Trypanosoma brucei. Les sous-unités α-, β-, γ-, δ-, ε- et p18 sont respectivement rouge, jaune, bleu, vert, magenta et cyan. (A et B) Représentations caricaturales des vues de côté et de dessus; (C-E) représentations de surface de (C), la F1-ATPase bovine, (D), le T. enzyme brucei en gris avec p18 enlevé et les coupes colorées montrant les acides aminés supplémentaires à l’enzyme bovine, et (E), l’enzyme T. brucei avec p18 présente.

Les structures et les fonctions des composants des ATP synthases, en particulier les sous-unités impliquées directement dans la formation catalytique de l’ATP, sont largement conservées chez les métazoaires, les champignons, les eubactéries et les chloroplastes végétaux. Sur la base d’une carte à 32.Résolution 5 Å déterminée in situ dans les mitochondries du parasite euglénozoaire, Trypanosoma brucei, par cryo-tomographie électronique, il a été proposé que l’ATP synthase chez cette espèce présente une structure non canonique avec différents sites catalytiques, où le doigt d’arginine catalytiquement essentiel est fourni, non pas par la sous-unité α adjacente au site de liaison des nucléotides catalytiques, comme chez toutes les espèces étudiées à ce jour, mais par une protéine appelée p18 trouvée uniquement chez les euglénozoaires. En collaboration avec les Drs Alena Zíková et Ondřej Gahura de l’Institut de Parasitologie de České Budějovice en République tchèque, nous avons caractérisé la F1-ATPase de T. brucei et déterminé une structure cristalline de l’enzyme à une résolution de 3,2 Å. Cette structure montre que la proposition selon laquelle le domaine catalytique de cette ATP synthase a une structure non canonique et des sites catalytiques différents est incorrecte. À bien des égards, la structure de la F1-ATPase de T. brucei est étroitement similaire à celles des F1-ATPases déterminées précédemment. La partie sphérique α3β3 du domaine catalytique, où se trouvent les trois sites catalytiques, plus la tige centrale, est fortement conservée, et le doigt d’arginine est fourni classiquement par les sous-unités α adjacentes à chacun des trois sites catalytiques trouvés dans les sous-unités β. Ainsi, l’enzyme a un mécanisme catalytique classique. La structure diffère des précédentes en ayant une sous-unité p18, identifiée uniquement chez les euglénozoaires, associée à la surface externe de chacune des trois sous-unités α, élaborant ainsi le domaine F1. La sous-unité p18 est une protéine à répétition pentatricopeptidique (PPR) avec trois PPRs et semble n’avoir aucune fonction dans le mécanisme catalytique de l’enzyme. T. brucei est l’agent causal de la maladie du sommeil chez l’homme et des maladies apparentées chez les animaux domestiques vivant en Afrique subsaharienne, et la structure de ses ATPases F1 fournit une cible pour le développement de nouveaux médicaments pour traiter la maladie.

Le rôle de la cardiolipine

La cardiolipine lipidique anionique est un composant essentiel des ATP synthases actives. Chez les métazoaires, leurs rotors contiennent un anneau de huit sous-unités c constitué de cercles internes et externes d’hélices α N- et C-terminales, respectivement. Le début de l’hélice α C-terminale contient un résidu de lysine strictement conservé et entièrement triméthylé dans la région du groupe de tête lipidique de la membrane. Des cycles plus grands de structure connue, en c9-c15 chez les eubactéries et les chloroplastes, conservent soit une lysine, soit un résidu d’arginine en position équivalente. Dans des simulations informatiques de membranes hydratées contenant des cycles c8 bovins triméthylés ou non méthylés et des cycles c10 ou c11 bactériens, les groupes de tête des molécules de cardiolipines se sont associés sélectivement à ces résidus de lysine modifiés et non modifiés et à des acides aminés polaires adjacents, et à une deuxième lysine conservée du côté opposé de la membrane, alors que les lipides phosphatidyles étaient peu attirés vers ces sites.

Figure Modes de liaison de la cardiolipine aux cycles c8 triméthylés. Les hélices α N- et C-terminales des sous-unités c sont respectivement gris foncé et gris clair. Les molécules de cardiolipine sont vertes, avec des groupes phosphates roses. De grandes sphères colorées représentent les billes de gros grains pour des acides aminés spécifiques, comme indiqué, situées à moins de 0,7 nm des billes de phosphate de cardiolipine. Les parties A et B, la région du groupe de tête de la cardiolipine dans la foliole interne de la membrane liée, respectivement, à deux sous-unités c adjacentes (sous-unités 8 et 1) et à une seule sous-unité c; la partie C, une molécule de cardiolipine dans la foliole externe de la membrane liée à une seule sous-unité c.

Cependant, les temps de séjour des molécules de cardiolipine avec l’anneau étaient brefs et suffisants pour que le rotor ne tourne que d’une fraction de degré dans l’enzyme active. Avec le cycle c8 déméthylé et avec les cycles c10 et c11, la densité des molécules de cardiolipine liées à ce site a augmenté, mais les temps de séjour n’ont pas été considérablement modifiés. Ces interactions très spécifiques mais brèves avec l’anneau en c rotatif sont compatibles avec les rôles fonctionnels de la cardiolipine dans la stabilisation et la lubrification du rotor et, en interagissant avec l’enzyme à l’entrée et à la sortie du canal protonique transmembranaire, dans la participation à la translocation du proton à travers le domaine membranaire de l’enzyme.

Simulation cinématographique de l’interaction de la cardiolipine avec le cycle c8 bovin natif. Le squelette protéique est représenté en gris clair, avec des chaînes latérales de Lys-43 (rouge), Gln-44 (jaune), Gln-45 (bleu) et Ser-48 (cyan) représentées sous forme de sphères. Les molécules de cardiolipine sont représentées sous forme de bâtonnets verts, avec des phosphates sous forme de sphères roses; Les molécules POPC et POPE sont représentées sous forme de bâtonnets gris foncé avec des phosphates sous forme de sphères gris foncé.