efter införandet av en särskilt neuroinvasiv och virulent stam av West Nile virus (WNV) i nordöstra USA fanns det ett dramatiskt utbrott av dödliga infektioner hos fåglar, åtföljd av mycket mindre men alarmerande antal dödliga infektioner hos hästar och människor.1,16,17,20,22 inom 3 år hade det nyligen introducerade Flavi-viruset svept över den nordamerikanska kontinenten och lämnat i sitt spår otaliga tusentals döda fåglar och tusentals bekräftade fall av sjukdom inklusive hundratals dödsfall hos hästar och människor. Rapporter om sjuklighet och dödlighet hos andra husdjur har varit mindre talrika. Fågel-och hästfall toppade i Mississippi under 2002.

i början av November 2002 presenterades en 2-årig, kastrerad maltesisk Terrier för den hänvisande veterinären med en akut början av episodisk, okontrollerad rullning, som snabbt utvecklades till helkroppsskakningar och ataxi. Initial behandling med oral fenobarbital och en kort kurs av prednison gav minimal förbättring. Efter 1 vecka, fallet hänvisades till Animal Health Center, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University, fröken. Den neurologiska undersökningen visade tecken på chorea bestående av ofrivilliga, oregelbundna, ryckiga oavsiktliga rörelser som involverade hela kroppen. De okulära globerna visade också liknande oregelbundna rörelser. Medvetna proprioception och hoppreaktioner minskade också mildt i frambenen. Sjukdomar som orsakar ofrivilliga oavsiktliga rörelser påverkar vanligtvis områden i hjärnbarken eller specifika extrapyramidala kärnor i telencephalon eller kranial hjärnstam.10 differentialdiagnosen inkluderade multifokala inflammatoriska sjukdomar-infektiösa, icke-infektiösa och immunmedierade. Fullständigt blodtal och serumkemi var obemärkliga, och cerebrospinalvätskeanalys (CSF) avslöjade inga signifikanta abnormiteter. Ett elektroencefalogram avslöjade förändringar som tyder på encefalit. På grundval av kliniska tecken och elektroencefalogramresultat behandlades hunden för infektiösa orsaker till encefalit. Under sjukhusvistelse på intensivvården blev hunden mycket spännande. Behandling med doxycyklin, klindamycin, diazepam, difenhydramin och vätskor misslyckades med att förhindra ökad svårighetsgrad av ofrivilliga rörelser och intermittenta perioder av hypertermi (upp till 108 F/42,2 C).

serologi för Toxoplasma gondii, Neospora caninum (ProtaTek, Chandler, AZ), Ehrlichia canis och Rickettsia rickettsii (Antech, Southaven, MO) var negativa och parade serum-och CSF-titrar för hundstörningsvirus och parvovirus (Colorado Veterinary Diagnostic Laboratory, Ft. Collins, CO) indikerade skyddande immunitet men misslyckades med att avslöja intratekal antikroppsproduktion. Efter 6 dagars sjukhusvistelse och behandling, ungefär 2 veckor efter starten av kliniska tecken, dog hunden på grund av dess försämrade tillstånd.

Necropsy undersökning avslöjade inga grova avvikelser. Mikroskopisk undersökning av hjärnan avslöjade en mild, multifokal, nonsuppurativ meningoencefalit, som involverade grå substans eller blandade grå/vita ämnesområden som hjärnstammen. Detta kännetecknades av små perivaskulära manschetter av lymfocyter i parenchymen och ibland de intilliggande leptomeningesna. Mild mikroglios av neuropilen följde ofta perivaskulär manschettning (Fig. 1). Foci av inflammation, som ibland var bilaterala, var närvarande i pyriformloben och associerad parahippocampal gyrus och hippocampus, pons och medulla och cerebellär cortex. En unik lesion nära medullas mittlinjeraphe vid nivån av olivarykärnorna bestod av ett område med nekros med fibrinutgjutning och blödning, kluster av makrofager (gitterceller) och många svullna axoner (sfäroider) med ett par små lymfocytiska manschetter i närheten (Fig. 2). Sfäroider färgade positivt av Bielschowskys metod för axoner.19 de enda andra signifikanta fynden var begränsade till levern, som visade ojämn individualisering av hepatocyter, cytoplasmatisk eosinofili, kärnpyknos och lys av hepatocyter (akut diffus måttlig levernekros), med många binukleata hepatocyter och utan signifikant inflammatorisk cellinfiltration. Många spirande jäst med pseudohyphae (Candida sp.) var närvarande i magslemet utan bevis på slemhinneinvasion eller inflammation.

Fig. 1. Cerebrum; hund. Spridda små perivaskulära manschetter av mononukleära inflammatoriska celler och mild mikroglios i pyriformloben. Han fläckar. Bar = 35 Crimson.

Fig. 2. Förlängda märgen; hund. Ett område vid mittlinjen raphe av medulla som visar många svullna axoner (sfäroider) indikerade med pilar, som omger ett område med nekros med blödning och makrofager. Han fläckar. Bar = 70 Crimson.

polymeraskedjereaktion (PCR) för WNV utfördes på fast hjärna och ofixerad ryggmärg, lever och njure. Bitar av formalinfixerad hjärna som väger 30-100 mg avlägsnades från medulla oblongata nära den skadade platsen och olika andra platser i hjärnstammen, hjärnbarken och cerebellum, sköljdes med vatten och placerades i rnalater-reagens (QIAgen, Valencia, CA) i minst 1 timme före RNA-extraktion. Prover av frusen ofixerad ryggmärg, njure och lever extraherades utan förbehandling. Vävnadsprover stördes med användning av en motordriven stöt (PelletPestle, Kontes, Vineland, NJ) och RNA extraherades med användning av trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) eller rnea-sy-minispinnkolumner (QIAgen) enligt tillverkarens instruktioner. Omvänd transkriptas-kapslad-polymeraskedjereaktion (rtnPCR) utfördes med användning av de kapslade primrarna och en modifiering av metoden som beskrivs av Johnson et al., 12 med kommersiella reagenssatser (OneStep bisexuell RT PCR, Qiagen, Valencia, CA och Taq SuperPak, Sigma, St.Louis, MO). Positiv kontroll var en 1 : 1 000 utspädning av poolat RNA extraherat från ofixerade WNV-positiva aviära vävnader (främst njure och hjärna). DNA-band detekterades efter agarosgelelektrofores med användning av GelStar (Cambrex, East Rutherford, NJ). Tre av fem stycken formalinfixerade medulla var positiva på rtnPCR, medan alla andra exemplar av fast hjärna (hjärnbark, cerebellum och hjärnstam) och ofixad (frusen) ryggmärg, njure och lever var negativa.

immunohistokemi (IHC) utfördes i ett försök att demonstrera WNV-antigen. Sektioner av formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) vävnader skars vid 5 kg och färgades med hjälp av en autostainer (Dako, Carpinteria, CA) och färdigförpackade streptavidin-biotin–pepparrotperoxidasdetekteringsreagenser (LSAB2, Dako), enligt tillverkarens instruktioner. Sektioner av hjärna, njure, bukspottkörtel, lever, hjärta, mjälte, binjur och tunga färgades med användning av murin polyklonal antikropp för WNV (VR-1267-AF, ATCC, Manassas, VA) efter förbehandling med proteinas K (Dako). Denna polyklonala antikropp visade måttlig diffus bakgrundsfärgning i alla vävnader, vilket komplicerar tolkningen. Ingen specifik färgning sågs utom möjligen i hjärnan där neuroner diffust visade enhetlig ljus cytoplasmatisk färgning jämfört med kontrollglas färgade med irrelevant monoklonal IgG1. Resultaten ansågs vara tvetydiga på grund av den höga bakgrundsfärgningen och diffusa naturen hos neuronfärgning, med liten variation i intensitet. Dessa resultat föreslog en brist på antigen i hundens hjärna, jämfört med infekterade fågelvävnader där robust cytoplasmatisk färgning sågs.Hjärnsektionerna färgades också med monoklonal antikropp mot nukleoprotein för valpsjuka (CDV-NP, VMRD, Pullman, WA), med negativa resultat. IHC på FFPE hjärnan för rabiesvirus utfördes i ett annat laboratorium (Prairie Diagnostic Service, Saskatoon, SK, Kanada), med negativa resultat.

även om dödlig encefalit på grund av WNV är väl dokumenterad hos många fågelarter,22 hästar,8 och människor,har 20 kliniska tecken på sjukdom orsakad av detta virus sällan dokumenterats hos hundar. I områden där WNV är endemisk indikerar en hög förekomst av specifik neutraliserande antikropp att infektion hos hundar är vanlig, även om klinisk sjukdom inte är det. En serosurvey från Sydafrika, där WNV är endemisk, visade att 37% av hundarna hade neutraliserande antikroppar mot WNV.5 en serosurvey i New York City, omedelbart efter den första identifieringen av WNV på västra halvklotet, visade att en högre andel hundar (10%) än hästar (3%) eller människor (2,5%) hade specifik neutraliserande antikropp nära epicentret för utbrottet (Queens).15 en tidigare rapport från Sydafrika beskrev isoleringen av ett virus, senare identifierat som WNV, från hjärnan hos en hund med allvarliga kliniska tecken på encefalit.7,21 i ett experiment producerade infektion av tre hundar med WNV asymptomatisk serokonversion hos alla tre men mätbara viremi hos endast ett av dessa djur, som senare visade sig lida av hyperadrenokorticism.5 en nyare studie med den amerikanska stammen visade låg nivå viremi hos alla fyra hundar och åtta katter infekterade,2 utan kliniska tecken hos hundar och endast mild, övergående febersjukdom hos katter.

två samtida rapporter om allvarlig WNV-infektion hos amerikanska hundar har publicerats. Buckweitz et al. beskrivet postmortem bevis på WNV-replikation i många vävnader av en 11-årig, manlig, blandad hund med njur-och centrala nervsystemet (CNS) sjukdom; kvantitativ omvänd transkriptas–polymeraskedjereaktion (RT-PCR) fann att virala sekvenser var vanligast i njure, följt av hjärta, hjärna, lunga och mjälte.6 Lichtensteiger et al. beskriv postmortemfynd efter eutanatisering av en 8-årig blandad hund med svår somatisk sjukdom som inkluderade myokardit, liksom dödlig WNV-encefalit hos en 3 månader gammal vargvalp.18 båda dessa rapporter dokumenterade antigen och genetiska sekvenser av WNV, med användning av IHC respektive RT-PCR, i flera extraneurala vävnader associerade med lesioner av nekros och inflammation.

denna rapport dokumenterar ett fall av allvarlig neurologisk sjukdom hos en ung vuxen hund med en 2 veckors varaktighet av CNS-tecken, där bevis på WNV-infektion var begränsad till hjärnan. Histologiska lesioner i hjärnan var ospecifika men kompatibla med fynd av WNV-encefalit rapporterade hos hästar,8 människor,20 och de två rapporterna hos hundar,6,18 båda med avseende på plats (hjärnstam och medulla) och typ (icke-suppurativ encefalit med områden med nekros). Kliniska tecken på balansförlust (rullande) och ataxi skulle vara kompatibla med cerebellomedullär sjukdom, medan skakningar i hela kroppen tyder på en mer diffus störning i hjärnan. Bevis på meningoencefalit hittades i pyriformloben och hippocampus, hjärnstammen och cerebellum/medulla men skonade mycket av prosencephalon. Levernekros i detta fall utan bevis på lokal viral replikation (PCR och IHC-negativ) var möjligen på grund av den allvarliga återkommande hypertermi. Leverskador på grund av tidigare virusreplikation som rensades under sjukdomen kan inte uteslutas även om ingen inflammation var uppenbar. Många binukleat hepatocyter föreslog subakut skada med regenerering. Förekomsten av Candida-jäst i magen ansågs vara en tillfällig upptäckt som kan hänföras till behandling med antibiotika. Kontrasterar med resultaten från Buckweitz et al.6 och Lichtensteiger et al., 18 inga lesioner, virala nukleinsyror eller viralt antigen detekterades i några extraneurala vävnader inklusive frusen och fast njure och lever från denna hund.

nekrosområdet som finns i hjärnstammen hos denna hund var associerat med ett lokaliserat makrofagrespons (gitterceller) men inte öppet lokalt inflammatoriskt infiltrat vilket tyder på, som beskrivits hos hästar,8 att lesionen kan ha en vaskulär eller eventuellt immunmedierad etiologi snarare än en direkt cytolytisk eller inflammatorisk etiologi. IHC för WNV på hjärnan kunde inte övertygande visa viralt antigen i detta fall och i det fall som rapporterats av Buckweitz et al., 6 indikerar lägre nivåer av viral replikation än vad som ses i fågelvävnader, återigen liknande fynd hos hästar.12 Lichtensteiger et al.18 rapporterade inte IHC i hjärnan.

den jämförelsevis högre frekvensen av neurologisk sjukdom som ses vid hästinfektioner med den amerikanska stammen av WNV jämfört med de i Italien8 stöds av experimentella studier på möss, vilket indikerar att den amerikanska stammen är mycket neuroinvasiv jämfört med andra stammar.3 ytterligare studier på möss har visat att exponering för gasformiga anestetika och CO2 ökar WNV-neuroinvasion på ett koncentrations-och tidsberoende sätt,4,13 vilket tyder på att andra miljö-eller värdfaktorer kan påverka utvecklingen av neurologisk sjukdom hos djur. Den låga förekomsten av klinisk sjukdom som ses hos hundar med hög seroprevalens tyder på att hundar är mer resistenta mot neuroinvasion än antingen människor eller hästar.

bevis på extraneural infektion hittades inte hos hästar med WNV-encefalomyelit8 som hos denna hund. Kanske, i denna maltesiska Terrier hade immunsvaret rensat viruset från extraneurala vävnader. Förekomsten av riklig viral replikation i extraneurala vävnader i de två andra rapporterna om amerikanska hundinfektioner tyder på att viss viral replikation sker i extraneurala vävnader före neuroinvasion och att njurarna och hjärtat sannolikt är målvävnader hos hunden. Buckweitz et al.6 föreslå njurbiopsi för diagnos av WNV-infektion hos hundar, men Lichtensteiger et al.18 hittade inget viralt antigen i njuren hos hunden de undersökte. Det kliniska värdet av njurbiopsy18 eller till och med urintestning för WNV, förmodligen med RT-PCR, har ännu inte utvärderats kritiskt.

Extraneural replikation av WNV hos människor kan extrapoleras från rapporter om dödlig encefalit hos mottagare av njurar från infekterade givare som började 13-18 dagar efter transplantation och från svår encefalit hos en hjärtmottagare,9,11 vilket indikerar att sjukdomen kan överföras genom blod eller organtransplantation. Ytterligare bevis på robust WNV-replikation i extraneurala vävnader hos däggdjur presenteras i en ny rapport som dokumenterar dödlig WNV-infektion i tre östra Rävekorrar, med bevis på njur -, cerebral -, hjärt -, lever-och lungvirusreplikation.14 ytterligare studier behövs för att belysa detaljerna i biologi och patofysiologi av WNV-infektioner hos däggdjur.

den fortsatta betydelsen av WNV för djur och människors hälsa i detta land kommer troligen att innebära att viruset blir endemiskt med sporadiska utbrott. Folkhälsomyndigheter ger ofta aktuell information om utbrott av mänsklig sjukdom. Det är möjligt att analys för antikroppar mot WNV i hund-och kattserum kan ge värdefull epidemiologisk information om spridningen och förekomsten av WNV.