Rotation driven av ATP-hydrolys

den hydrolytiska rotationscykeln består av tre 120o-steg i enzymets katalytiska F1-domän, definierad i biofysiska rotationsexperiment med ”katalytiska dwells” . Varje 120o-steg är uppdelat i delsteg definierade av en katalytisk uppehåll efter varje 120o-steg, med en mellanliggande ”ATP-bindning” uppehåll vid 30o och en ”fosfatfrisättning” uppehåll vid 95o. Frisättning av fosfat tillåter enzymet att slutföra 120o-steget och komma fram till ATP-bindningsboendet. Vi har beskrivit strukturerna för den F1-katalytiska domänen vid fosfatfrisättningen och katalytiska bor, och har visat att 35o-rotary-delsteget mellan fosfatfrisättning och katalytiska bor beror på frisättningen av fosfat från ”ATP-bindningen”, vilket sedan tillåter enzymet att fortsätta till ”katalytisk bo” . Den katalytiska bo i sig representerar en övergång där en bunden ATP-molekyl blir redo för hydrolys. Våra nuvarande ansträngningar är centrerade kring att definiera det katalytiska uppehållet i encefalopati F1-ATPas.

filmgenerering av 30o-rotation av tubi-subenheten i encefalopati F1-ATPas genom frisättning av fosfat från kubi-subenheten. Filmen börjar med en vy från sidan av F1-ThioP i bandrepresentation, med det bundna tiofosfatet som orange sfärer. Underenheterna för och underenheterna för att göra detta är röda respektive gula. Då aTP-, adb-, ßTP – och ßDP-subenheter tas bort jämfört med föregående kvartal lämnar aEßE-dimer och den centrala stjälk subenheter γ, δ och ε (blå, röd och grön, respektive). Denna återstående delkomplex vrids till höger runt y-axeln med 100 kg för att exponera en sidovy av aE-subenheten och den centrala stjälken. Därefter avlägsnas underenheterna och återstoden av underenheterna och återstoden av underenheten och underenheten av underenheten blir svagare. I de sista ramarna frigörs det bundna fosfatet och aE-subenheten öppnas och rör sig bort från den kubanska subenheten, vilket stör packningsinteraktionerna mellan AE-och den kubanska subenheten. För att återupprätta dessa interaktioner roterar underenheten av en kub 30. Strukturen för det slutliga tillståndet är tillståndet efter fosfatfrisättning av bovint F1-ATPas som finns i F1-i3-Tiop.

Rotation driven av pmf

nyckeln saknas datum för att förstå genereringen av rotation från pmf är den detaljerade strukturen på atomnivå av vägen protonerna ta genom membrandomänen av enzymet. Den bästa tillgängliga strukturen hittills är den som vi bestämde vid 4 ml upplösning 2015 genom röntgenkristallografi av enzymkomplexet från Paracoccus denitrificans . Andra bestämdes i 2015 och 2016 genom kryoelektronmikroskopi av enskilda partiklar av bovint och svampenzymer, i bästa fall vid 6 ml upplösning . Dessa modeller saknar emellertid alla detaljer som krävs för formulering av en molekylär mekanism för generering av rotation från protonmotivkraften, och på grund av enzymernas rörlighet och flexibilitet kan enskilda partiklar av enzymet anta många olika positioner. Därför presenterar det ett ovanligt svårt problem för cryo-em-metoden.

figur membrandomänen för F-ATPas från P. angusta. I A-D är A-subenheten majsblå. A och B, vyer i solid representation från sidan och under membrandomänen. C10-ringen är grå, b-subenheten (övre delen visas inte) är rosa, och de ljusgula, tegelröda, ljusa cyan-och beige segmenten är transmembrane-spiraler, Ch1-Ch4 tilldelade subenheten f, ATP8, aH1 respektive bH1. I c-ringen indikerar I-IV de fyra transmembran C-terminala C-spiralerna i kontakt med underenheten A. C och D, vyer av a-subenheten i solid och tecknad representation sett utifrån och tittar ut från gränssnittet med c-ringen, respektive, med aH1 i blek cyan. Konserverade polära rester är gula, positionerna för humana mutationer associerade med patologier (Se tabell S1) är röda. Den rosa sfären betecknar den konserverade Arg-179 i aH5 som är nödvändig för protontranslokation. Den nedre pilen indikerar inloppsvägen för protoner som överför till Glu-59 i C-terminalen C-helix-II av c-ringen. De bärs runt ringen genom moturs rotation sett ovanifrån tills de anländer till Arg-179 där de går in i utgångsvägen, betecknad med den övre pilen.

strukturer av bakteriella ATP-syntas

figur bakteriella ATP-syntas. A) F1-ATPas från Caldalkalibacillus thermarum vid upplösning på 2,6 ci genom röntgenkristallografi; B) ATP-syntas enzym från Paracoccus denitrificans vid upplösning på 4 C med röntgenkristallografi; C) ATP-syntas från Escherichia coli vid upplösning på 7 C med cryo-EM.

i förhållande till de omfattande studier som vi har utfört på mitokondriella enzymer har strukturerna av bakteriella ATP-syntas undersökts lite, med undantag för strukturer av F1-katalytiska domäner av enzymerna från Escherichia coli och Geobacillus stearothermophilus (tidigare Bacillus stearothermophilus) vid 3,2 respektive 3,9 ml upplösning respektive strukturer av c-ringarna från deras membrandomäner från olika arter . För att fylla denna lacuna har vi hittills bidragit med strukturen för hela enzymet från Paracoccus denitrificans vid 4-upplösning , och i samarbete med Professor G. M. Cook och kollegor i Dunedin, Nya Zeeland, strukturerna för F1-katalytiska domäner av ATP-syntas från Caldalkalibacillus thermarum, Fusobacterium nucleatum och Mycobacterium smegmatis. C. thermarum är en termoalkalifil, och strukturen för dess katalytiska domän vid 2,6 ml upplösning är den mest exakta strukturen hos en bakteriell F1-ATPas som ännu bestämts . Enzymet från M. smegmatis är nära besläktat med enzymet från M. tuberculosis. Strukturen för dess katalytiska domän har bestämts till 4 ml upplösning och ger ett mål för utveckling av nya anti-tuberkulära läkemedel . Den opportunistiska periodontala patogenen, Fusobacterium nucleatum, är associerad med ett brett spektrum av sjukdomar inklusive orala infektioner, förskott graviditetsresultat, gastrointestinala sjukdomar och ateroskleros. Det har också kopplats till utveckling och progression av kolorektal cancer via hämning av immunsignalvägar mot tumörer och efterföljande främjande av kemoresistans. Det är en obligatorisk anaerob och kopplar den fria energin från dekarboxylering av glutaconyl-CoA till crotonyl-CoA till transport av Na+ joner över dess cellulära membran för att generera en natriumjonmotivkraft (smf). ATP-syntas använder smf för att driva syntesen av ATP som krävs för kataboliska och anabola reaktioner. Strukturen för dess F1-katalytiska domän har bestämts vid 3,6 ml upplösning . Med hjälp av cryo-EM har en karta över det intakta ATP-syntas av E. coli publicerats som visar Kubi-subenheten i” upp ” – positionen (se nedan) , och nyligen har en struktur av ATP-syntas från Geobacillus stearothermophilus bestämts till 3 kg .

struktur av parasit ATP-syntas

figur F1-ATPas från Trypanosoma brucei. Underenheterna underjung -, underjung -, underjung -, underjung -, underjung-och P18 är röda, gula, blåa, gröna, magenta respektive cyan. (A och B) tecknade representationer av sido-och toppvyerna; (C-E) ytrepresentationer av (C), bovint F1-ATPas, (D), T. brucei-enzym i grått med P18 avlägsnat och de färgade sektionerna som visar aminosyrorna ytterligare till bovint enzym, och (E), T. brucei-enzymet med P18 närvarande.

strukturerna och funktionerna hos komponenterna i ATP-syntas, särskilt de underenheter som är involverade direkt i den katalytiska bildningen av ATP, bevaras allmänt i metazoaner, svampar, eubakterier och växtkloroplaster. På grundval av en karta på 32.5. upplösning på plats i mitokondrierna hos euglenozoan-parasiten, Trypanosoma brucei, genom elektronkryotomografi, har det föreslagits att ATP-syntas hos denna art har en icke-kanonisk struktur med olika katalytiska platser, där det katalytiskt väsentliga argininfingeren tillhandahålls, inte av den Kubi-subenheten intill den katalytiska nukleotidbindningsstället, som hos alla arter som hittills undersökts, utan av ett protein som kallas p18 som endast finns i euglenozoa . I ett samarbete med Drs Alena Zíková och Axel Gahura från Institutet för Parasitologi vid České Budějovice i tjeckien, har vi som kännetecknas F1-Atpas från T. brucei och fastställt en kristallstruktur av enzymet på 3,2 Å upplösning . Denna struktur visar att förslaget att den katalytiska domänen för detta ATP-syntas har en icke-kanonisk struktur och olika katalytiska platser är felaktig. I många avseenden är strukturen hos T. brucei F1-ATPas nära lik den för F1-Atpaser som bestämts tidigare. Den kub3-sfäriska delen av den katalytiska domänen, där de tre katalytiska platserna finns, plus den centrala stjälken, är mycket konserverade, och argininfingeren tillhandahålls konventionellt av de Kubi-underenheterna intill var och en av de tre katalytiska platserna som finns i Kubi-underenheterna. Således har enzymet en konventionell katalytisk mekanism. Strukturen skiljer sig från tidigare genom att ha en p18-subenhet, identifierad endast i euglenozoa, associerad med den yttre ytan av var och en av de tre subenheterna i CI, och därigenom utarbeta F1-domänen. Subenhet p18 är ett pentatrikopeptidrepetition (PPR) protein med tre PPRs och verkar inte ha någon funktion i enzymets katalytiska mekanism. T. brucei är orsakssambandet till sömnsjukdom hos människor och relaterade sjukdomar hos husdjur som lever i Afrika söder om Sahara, och strukturen i dess F1-Atpaser ger ett mål för utveckling av nya läkemedel för behandling av sjukdomen.

kardiolipins Roll

anjonisk lipidkardiolipin är en väsentlig komponent i aktiva ATP-syntas. I metazoaner innehåller deras rotorer en ring av åtta c – underenheter bestående av inre och yttre cirklar av n-respektive C-terminalcunii-helices. Början av den C-terminala C-helixen innehåller en strikt konserverad och fullständigt trimetylerad lysinrest i membranets lipidhuvudgruppsregion. Större ringar med känd struktur, från c9-c15 i eubakterier och kloroplaster, bevarar antingen en lysin eller en argininrest i motsvarande läge. I datorsimuleringar av hydratiserade membran innehållande trimetylerade eller ometylerade bovina C8-ringar och bakteriella c10-eller c11-ringar associerades huvudgrupperna av kardiolipinmolekyler selektivt med dessa modifierade och omodifierade lysinrester och med intilliggande polära aminosyror och med en andra konserverad lysin på motsatt sida av membranet, medan fosfatidylipider lockades lite till dessa platser .

Figursätt för bindning av kardiolipin till trimetylerade c8-ringar. De n-och C-terminala C-spiralerna av C-subenheter är mörka respektive ljusgråa. Kardiolipinmolekyler är gröna, med rosa fosfatgrupper. Stora färgade sfärer representerar de grova kornpärlorna för specifika aminosyror, som anges, som ligger inom 0,7 nm av fosfatpärlorna av kardiolipin. Delar A och B, huvudgruppsregionen av kardiolipin i membranets inre broschyr bunden till två intilliggande c-subenheter (underenheter 8 och 1) och till en enda c-subenhet; del C, en kardiolipinmolekyl i membranets yttre broschyr bunden till en enda c-subenhet.

uppehållstiderna för kardiolipinmolekyler med ringen var emellertid korta och tillräckliga för att rotorn endast skulle vända en bråkdel av en grad i det aktiva enzymet. Med den demetylerade c8-ringen och med c10 – och c11-ringarna ökade densiteten hos bundna kardiolipinmolekyler på denna plats, men uppehållstiderna ändrades inte kraftigt. Dessa mycket specifika men korta interaktioner med den roterande c-ringen överensstämmer med funktionella roller för kardiolipin vid stabilisering och smörjning av rotorn och genom att interagera med enzymet vid inloppet och utgången av transmembranprotonkanalen, i deltagande i protontranslokation genom membrandomänen hos enzymet.

filmsimulering av interaktion av kardiolipin med den inhemska bovin C8-ringen. Protein ryggrad visas i ljusgrå, med sidokedjor av Lys-43 (röd), Gln-44 (gul), Gln-45 (blå) och Ser-48 (cyan) visas som sfärer. Kardiolipinmolekyler visas som gröna pinnar, med fosfater som rosa sfärer; POPC och POPE molekyler visas som Mörkgrå pinnar med fosfater som Mörkgrå sfärer.