beskrivning och allmänna anteckningar

Restriction Endonucleases (REs) är bakteriella enzymer som klyver dubbelsträngat DNA. Typ i REs är viktiga i bakteriell funktion men klyver inte DNA vid specifika sekvenser. Typ II REs, som beskrivs för användning i denna handbok, kräver mycket specifika platser för DNA-klyvning och är således extremt användbara verktyg inom molekylärbiologi. Dessa enzymer möjliggör kloning och rening av definierade DNA-fragment. De 500 eller så kända REs är vanligtvis isolerade från en mängd olika bakteriestammar.

REs finns i bakterier som förmodligen förstör DNA från främmande källor (t.ex. infekterar bakteriofag) genom att klyva det främmande DNA på specifika igenkänningsställen. Värdbakteriens DNA skyddas från klyvning eftersom de specifika igenkänningsställena modifieras, vanligtvis genom metylering vid en av baserna på platsen, vilket gör platsen inte längre ett substrat för åter klyvning. Praktiskt taget har REs med olika igenkänningsställespecifikationer renats från olika bakteriestammar och används av molekylärbiologer under definierade förhållanden för att klyva renat DNA från eukaryota källor till definierade fragment i en in vitro-reaktion. Värdbakterier som används för att sprida klonat DNA i laboratoriet är vanligtvis mutanta i värdbegränsningsgenerna (hsdR, hsdM eller hsdS); således kommer deras intracellulära enzymaktiviteter inte att förstöra de främmande rekombinanta sekvenserna.

dessa ändar är komplementära (”klibbig”) och kan enzymatiskt fästas på någon annan EcoRI-genererad Termini med användning av T4 DNA-ligas. Andra REs känner igen olika sekvenser och gör unika klyvningar som resulterar i andra definierade termini, av vilka några också har 5′ utskjutande ändar, 3′ utskjutande ändar eller inga utskjutande (trubbiga) ändar (se tabell 5.1). Varje RE har en specifik sekvens och antal nukleotider som krävs för att skapa igenkänningsstället. Vissa REs kräver inte en specifik nukleotid i varje position på igenkänningsstället. Till exempel är i vissa fall en purinnukleotid (A eller G) i en definierad position tillräcklig. Frekvensen med vilken en RE kommer att skära DNA är således relaterad till antalet baser i igenkänningssekvenserna (om fler baser krävs är färre nedskärningar lämpliga att göra) och de specifika baserna i vilken position som helst.

REs är användbara eftersom deras specificitet och den resulterande ligatabla termini tillåter dissektion, analys och omstrukturering av DNA på ett kontrollerat, förutsägbart, platsspecifikt sätt. Eftersom de är enzymer har var och en specifika krav på förhållanden som leder till optimal klyvningsaktivitet. Lyckligtvis är många aktiva under liknande förhållanden, med den primära variabeln jonstyrka (dvs NaCl i bufferten). Praktiska förhållanden har empiriskt definierats för att använda varje RE som ett forskningsverktyg.

mängden re-aktivitet definieras vanligtvis inte med klassisk enzymkinetik. Snarare definieras re-aktivitet i praktiska termer för användning i laboratoriet. En enhet (U) av aktivitet för en RE definieras vanligtvis som mängden enzym som kommer att skära 1 ci g på alla specifika platser i ett DNA-prov (vanligtvis bakteriofag CI) i 1 timme vid 37 C. Den faktiska aktiviteten uppnås kan vara annorlunda om ytterligare re matsmältning platser är närvarande. Till exempel, om 1 U av en RE är tillräcklig för att skära 1 crunch bakteriofag-DNA helt på ett ställe under standardanalysförhållanden, kanske det inte kan skära helt 1 crunch av ett DNA-prov som har fyra platser för en RE, eller ett prov som inte har renats tillräckligt.

andra faktorer som rör reaktionsbetingelserna påverkar också Re-aktiviteten. Dessa inkluderar renhet av DNA, buffert, temperaturförhållanden och RE själv. DNA-metylering, bundet protein eller överdriven viskositet av DNA med hög molekylvikt i viskösa lösningar kan minska effektiviteten hos en re-digest. DNA som ska skäras bör vanligtvis vara fritt från föroreningar; SS-fenol/kloroform extraktion och etanolutfällning (avsnitt 20-1) tar bort många störande föroreningar. Däremot påverkas de flesta REs vanligtvis inte negativt av RNA eller enkelsträngat DNA. Således kan tillsatsen av tRNA som en coprecipitant vara användbar för att återvinna små mängder DNA utan att påverka efterföljande re-smältningar.

det typiska analysförhållandet för en re-reaktion innehåller en buffert (10 mM Tris, pH 7,4 är vanligt), 10 mM Mg2+ och är fri från betydande koncentrationer av kelatmedel (te-buffert innehåller en tillräckligt låg mängd EDTA). RE-buffertarna innehåller också lämpliga saltkoncentrationer för att ge optimal jonstyrka för varje RE. I vissa fall tillsätts BSA, DTT och spermidin för att ge optimal enzymaktivitet. Fyra generaliserade re-buffertar kan uppfylla kraven för de flesta REs, och förberedelserna av 10 ozonlager av dessa buffertar beskrivs nedan. De flesta re digests utförs vid 37 kub C, även om det finns några undantag, såsom TaqI.

de flesta köpta REs levereras med en lämplig lagringsbuffert, men detta innehåller 25-50% glycerol för att förhindra frysning under lagring vid -20 C. koncentrationer av glycerol på över 5% (vol/vol) I re digestionsanalyser kan hämma aktiviteten hos många REs. dessutom kan höga glycerolkoncentrationer under re digestion slappna av sekvensspecificiteten hos vissa REs, vilket resulterar i falska klyvningar. Till exempel ses detta fenomen med den vanliga RE EcoRI, där den falska aktiviteten som observerats under vissa förhållanden kallas EcoRI* (stjärna) aktivitet. Av dessa skäl är det viktigt att göra volymen av re-matsmältningsreaktionen tillräckligt stor för att omfatta minst en 1:10-utspädning av RE själv (och därmed minska glycerolkoncentrationen). Andra faktorer, såsom pH, etanol eller felaktig saltkoncentration kan också orsaka stjärnaktivitet eller minskad aktivitet; därför är noggrann efterlevnad av rekommenderade förhållanden viktigt.

några andra överväganden är användbara vid användning av REs. använd en ny pipettspets varje gång en RE överförs. Spårmängder av föroreningar som tillsätts till re-beståndet kan förhindra dess vidare användning och förvirra resultat som erhållits i efterföljande experiment. Vid optimering av reaktioner är det bättre att lägga till ytterligare RE än att inkubera mycket längre än 1 timme. vidare definieras enzymaktivitet som nämnts ovan endast för skärning av en DNA-standard. Eftersom ditt prov i allmänhet är helt annorlunda än standarden är en bra guide att använda cirka 2-3 U RE per mikrogram DNA som ska skäras, särskilt när man försöker smälta ett svårt prov. Det kan ibland vara nödvändigt att titrera mängden RE som behövs för att smälta ett DNA-prov på lämpligt sätt.

slutligen, om två REs ska användas, måste man uppmärksamma de optimala saltförhållandena för var och en. Om båda kräver samma buffert kan matsmältningen göras antingen samtidigt eller sekventiellt. Om olika saltförhållanden krävs måste RE som kräver mindre salt användas först. Efter inkubation justera salt tillstånd, och smälta med RE kräver hög salt. RE aktivitet kan avlägsnas genom SS-fenol / kloroform extraktion i alla fall. Vissa REs är termolabila och kan inaktiveras genom uppvärmning till 70 C i 5 min. Den här egenskapen varierar dock från en RE till nästa och bör verifieras för varje Re används.