DESCRIPTION ET NOTES GÉNÉRALES
Les endonucléases de restriction (REs) sont des enzymes bactériennes qui clivent l’ADN double brin. Les RÉS de type I sont importantes dans la fonction bactérienne, mais ne clivent pas l’ADN à des séquences spécifiques. Les RES de type II, décrites dans ce manuel, nécessitent des sites très spécifiques pour le clivage de l’ADN et sont donc des outils extrêmement utiles en biologie moléculaire. Ces enzymes permettent le clonage et la purification de fragments d’ADN définis. Les quelque 500 RÉS connues sont généralement isolées d’une variété de souches bactériennes.
Les RES sont présentes dans les bactéries vraisemblablement pour détruire l’ADN provenant de sources étrangères (par exemple, infectant des bactériophages) en coupant l’ADN étranger à des sites de reconnaissance spécifiques. L’ADN de la bactérie hôte est protégé contre le clivage car les sites de reconnaissance spécifiques sont modifiés, généralement par méthylation à l’une des bases du site, ce qui fait que le site n’est plus un substrat pour le clivage. En pratique, des RÉS avec différentes spécificités de site de reconnaissance ont été purifiées à partir de diverses souches bactériennes et sont utilisées par les biologistes moléculaires dans des conditions définies pour cliver l’ADN purifié de sources eucaryotes en fragments définis dans une réaction in vitro. Les bactéries hôtes utilisées pour propager l’ADN cloné en laboratoire sont généralement mutantes dans les gènes de restriction de l’hôte (hsdR, hsdM ou hsdS); ainsi, leurs activités enzymatiques intracellulaires ne détruiront pas les séquences recombinantes étrangères.
Les spécificités du site de clivage pour de nombreuses RES ont été définies. Par exemple, la RE EcoRI exige que les six paires de base prises dans l’ordre spécifique:
EcoRI reconnaît cette séquence et s’attache dans un mode unique, résultant en deux termini en saillie 5′ de fin:
Ces objectifs sont complémentaires (« sticky”) et peut être enzymatiquement rattachée à aucune autre EcoRI-généré à la gare termini, à l’aide de T4 ADN ligase. D’autres REs reconnaissent des séquences différentes et font des clivages uniques résultant en d’autres terminaisons définies, dont certaines ont également des extrémités saillantes de 5 ’, des extrémités saillantes de 3’ ou aucune extrémité saillante (émoussée) (voir Tableau 5.1). Chaque RE a une séquence spécifique et un nombre de nucléotides nécessaires pour créer le site de reconnaissance. Certaines RES ne nécessitent pas un nucléotide spécifique dans chaque position du site de reconnaissance. Par exemple, dans certains cas, un nucléotide purine (A ou G) dans une position définie suffit. La fréquence à laquelle un RE va couper l’ADN est donc liée au nombre de bases dans les séquences de reconnaissance (si plus de bases sont nécessaires, moins de coupes sont susceptibles d’être faites) et aux bases spécifiques dans n’importe quelle position.
Les RÉS sont utiles car leur spécificité et les terminaisons ligaturables qui en résultent permettent la dissection, l’analyse et la restructuration de l’ADN de manière contrôlée, prévisible et spécifique au site. Parce que ce sont des enzymes, chacune a des exigences spécifiques pour les conditions conduisant à une activité de clivage optimale. Heureusement, beaucoup sont actifs dans des conditions similaires, la variable principale étant la force ionique (c.-à-d. NaCl dans le tampon). Des conditions pratiques ont été définies empiriquement pour l’utilisation de chaque ER comme outil de recherche.
La quantité d’activité RÉ n’est généralement pas définie en utilisant la cinétique enzymatique classique. L’activité RE est plutôt définie en termes pratiques pour une utilisation en laboratoire. Une unité (U) d’activité pour un RE est généralement définie comme la quantité d’enzyme qui coupera 1 µg à tous les sites spécifiques d’un échantillon d’ADN (généralement un bactériophage λ) en 1 heure à 37 ° C. L’activité réelle atteinte peut être différente si des sites de digestion supplémentaires sont présents. Par exemple, si 1 U d’un RE est suffisant pour couper complètement 1 µg d’ADN du bactériophage λ à un site dans des conditions de dosage standard, il peut ne pas être en mesure de couper complètement 1 µg d’un échantillon d’ADN qui a quatre sites pour un RE, ou un échantillon qui n’a pas été suffisamment purifié.
D’autres facteurs concernant les conditions de réaction affectent également l’activité RÉ. Ceux-ci incluent la pureté de l’ADN, le tampon, les conditions de température et le RE lui-même. La méthylation de l’ADN, la protéine liée ou la viscosité excessive de l’ADN de haut poids moléculaire dans des solutions visqueuses peuvent diminuer l’efficacité d’une RE digest. L’ADN à couper doit généralement être exempt d’impuretés; l’extraction du SS-phénol / chloroforme et la précipitation de l’éthanol (section 20-1) élimineront de nombreuses impuretés gênantes. En revanche, la plupart des RES ne sont généralement pas affectées négativement par l’ARN ou l’ADN simple brin. Ainsi, l’ajout d’ARNt en tant que coprécipitant peut être utile pour récupérer de petites quantités d’ADN sans affecter les digérations ultérieures.
La condition d’essai typique pour une RE réaction contient un tampon (Tris de 10 mM, pH 7,4 est courant), 10 mm Mg2+ et est exempte de concentrations substantielles d’agents chélatants (le tampon TE contient une quantité suffisamment faible d’EDTA). Les tampons RE contiennent également des concentrations de sel appropriées pour donner la force ionique optimale pour chaque RE. Dans certains cas, la BSA, la TNT et la spermidine sont ajoutées pour fournir une activité enzymatique optimale. Quatre tampons RE généralisés peuvent satisfaire aux exigences de la plupart des ER, et la préparation préalable de 10 × stocks de ces tampons est décrite ci-dessous. La plupart des ré-digérations sont effectuées à 37 ° C, bien qu’il existe quelques exceptions, telles que le TaqI.
La plupart des résines achetées sont expédiées avec un tampon de stockage approprié, mais celui-ci contient de 25 à 50% de glycérol pour éviter le gel pendant le stockage à -20 ° C. Des concentrations de glycérol supérieures à 5% (vol / vol) dans les dosages de digestion peuvent inhiber l’activité de nombreuses résines. De plus, des concentrations élevées de glycérol pendant la digestion peuvent détendre la spécificité de séquence de certaines résines, ce qui entraîne des clivages parasites. Par exemple, ce phénomène est observé avec le RE EcoRI couramment utilisé, où l’activité parasite observée dans certaines conditions est appelée activité EcoRI * (étoile). Pour ces raisons, il est important de rendre le volume de la réaction de digestion du RE suffisamment important pour englober au moins une dilution 1:10 du RE lui-même (et ainsi réduire la concentration en glycérol). D’autres facteurs, tels que le pH, l’éthanol ou une mauvaise concentration en sel peuvent également provoquer une activité stellaire ou une diminution de l’activité; il est donc important de respecter scrupuleusement les conditions recommandées.
Quelques autres considérations sont utiles lors de l’utilisation de REs. Utilisez une nouvelle pointe de pipette chaque fois qu’un RE est transféré. Des quantités infimes de contaminants ajoutés au stock d’ER peuvent empêcher son utilisation ultérieure et confondre les résultats obtenus lors d’expériences ultérieures. Lors de l’optimisation des réactions, il est préférable d’ajouter du RE supplémentaire que d’incuber pendant beaucoup plus de 1 heure. De plus, comme mentionné ci-dessus, l’activité enzymatique n’est définie que pour couper un étalon d’ADN. Parce que votre échantillon est généralement très différent de la norme, un bon guide consiste à utiliser environ 2-3 U de RÉ par microgramme d’ADN à couper, en particulier lorsque vous essayez de digérer un échantillon difficile. Il peut parfois être nécessaire de titrer la quantité d’ER nécessaire pour digérer un échantillon d’ADN de manière appropriée.
Enfin, si deux REs doivent être utilisées, il faut faire attention aux conditions optimales de sel de chacune. Si les deux nécessitent le même tampon, la digestion peut être effectuée simultanément ou séquentiellement. Si des conditions de sel différentes sont requises, le RE nécessitant moins de sel doit être utilisé en premier. Après l’incubation, ajustez l’état du sel et digérez avec le RE nécessitant une teneur élevée en sel. L’activité RÉ peut être éliminée par extraction de SS-phénol / chloroforme dans tous les cas. Certaines RÉS sont thermolabiles et peuvent être inactivées par chauffage à 70°C pendant 5 min. Cette propriété, cependant, varie d’une RE à l’autre et doit être vérifiée pour chaque RE utilisée.