Après l’introduction d’une souche particulièrement neuroinvasive et virulente du virus du Nil occidental (VNO) dans le nord-est des États-Unis, il y a eu une flambée spectaculaire d’infections mortelles chez les oiseaux, accompagnée d’un nombre beaucoup plus faible mais alarmant d’infections mortelles chez les chevaux et les humains.1,16,17,20,22 En 3 ans, le Flavi-virus nouvellement introduit avait balayé le continent nord-américain, laissant sur ses traces des milliers incalculables d’oiseaux morts et des milliers de cas confirmés de maladie, dont des centaines de décès chez les chevaux et les humains. Les rapports de morbidité et de mortalité chez d’autres animaux domestiques ont été moins nombreux. Les cas aviaires et équins ont atteint un sommet au Mississippi en 2002.

Au début de novembre 2002, un Terrier maltais stérilisé de 2 ans a été présenté au vétérinaire référent avec un début aigu de roulement épisodique et incontrôlé, qui a rapidement évolué vers des tremblements du corps entier et une ataxie. Le traitement initial par le phénobarbital oral et une courte cure de prednisone ont donné une amélioration minimale. Après 1 semaine, le cas a été renvoyé au Centre de santé animale, Collège de médecine vétérinaire, Université d’État du Mississippi, MS. L’examen neurologique a montré des signes de chorée consistant en mouvements involontaires, irréguliers et saccadés impliquant tout le corps. Les globes oculaires présentaient également des mouvements erratiques similaires. La proprioception consciente et les réactions de saut ont également légèrement diminué dans les membres antérieurs. Les maladies provoquant des mouvements adventices involontaires affectent généralement des zones du cortex cérébral, ou des noyaux extrapyramidaux spécifiques du télencéphale, ou du tronc cérébral crânien.10 Le diagnostic différentiel comprenait des maladies inflammatoires multifocales – infectieuses, non infectieuses et à médiation immunitaire. La numération formule sanguine complète et la chimie du sérum n’étaient pas remarquables, et l’analyse du liquide céphalo-rachidien (LCR) n’a révélé aucune anomalie significative. Un électroencéphalogramme a révélé des changements suggérant une encéphalite. Sur la base des signes cliniques et des résultats de l’électroencéphalogramme, le chien a été traité pour des causes infectieuses d’encéphalite. Lors de l’hospitalisation en unité de soins intensifs, le chien est devenu très excitable. Le traitement par la doxycycline, la clindamycine, le diazépam, la diphenhydramine et les liquides n’a pas permis de prévenir la sévérité croissante des mouvements involontaires et des périodes intermittentes d’hyperthermie (jusqu’à 108 F / 42,2 C).

La sérologie de Toxoplasma gondii, Neospora caninum (ProtaTek, Chandler, AZ), Ehrlichia canis et Rickettsia rickettsii (Antech, Southaven, MO) était négative et les titres de sérum et de LCR appariés pour le virus de la maladie de Carré et le parvovirus canins (Colorado Veterinary Diagnostic Laboratory, Ft. Collins, CO) a indiqué une immunité protectrice mais n’a pas révélé la production d’anticorps intrathécaux. Après 6 jours d’hospitalisation et de traitement, environ 2 semaines après l’apparition des signes cliniques, le chien a été euthanasié en raison de sa détérioration.

L’examen nécropsie n’a révélé aucune anomalie grave. L’examen microscopique du cerveau a révélé une méningo-encéphalite légère, multifocale et non suppurative, qui impliquait de la matière grise ou des zones mixtes de substance grise / blanche telles que le tronc cérébral. Ceci était caractérisé par de petites manchettes périvasculaires des lymphocytes dans le parenchyme et parfois les leptoméninges adjacents. Une microgliose légère du neuropile accompagnait souvent la menotte périvasculaire (Fig. 1). Des foyers d’inflammation, parfois bilatéraux, étaient présents dans le lobe pyriforme et le gyrus et l’hippocampe parahippocampiques associés, les pons et la moelle épinière et le cortex cérébelleux. Une lésion unique proche du raphé médian de la moelle au niveau des noyaux olivaires consistait en une zone de nécrose avec épanchement de fibrine et hémorragie, des amas de macrophages (cellules gitter) et de nombreux axones enflés (sphéroïdes) avec quelques petites manchettes lymphocytaires à proximité (Fig. 2). Sphéroïdes colorés positivement par la méthode de Bielschowsky pour les axones.19 Les seuls autres résultats significatifs ont été limités au foie, qui a montré une individualisation inégale des hépatocytes, une éosinophilie cytoplasmique, une pyknose nucléaire et une lyse des hépatocytes (nécrose hépatique aiguë diffuse modérée), avec de nombreux hépatocytes binucléés et sans infiltration cellulaire inflammatoire significative. De nombreuses levures bourgeonnantes à pseudohyphes (Candida sp.) étaient présents dans le mucus gastrique sans signe d’invasion ou d’inflammation des muqueuses.

Fig. 1. Cerveau; chien. Petites manchettes périvasculaires dispersées de cellules inflammatoires mononucléées et microgliose légère dans le lobe pyriforme. IL tache. Barre = 35 µm.

Fig. 2. Moelle oblongue; chien. Une zone au raphé médian de la moelle présentant de nombreux axones gonflés (sphéroïdes) indiqués par des flèches, entourant une zone de nécrose avec hémorragie et macrophages. IL tache. Barre = 70 µm.

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour le VNO a été réalisée sur une moelle épinière, un foie et un rein fixes et non fixes. Des morceaux de cerveau fixés au formol pesant de 30 à 100 mg ont été retirés de la moelle oblongue près du site lésé et de divers autres sites du tronc cérébral, du cortex cérébral et du cervelet, rincés à l’eau et placés dans le réactif RNAlater ™ (QIAgen, Valencia, CA) pendant au moins 1 heure avant l’extraction de l’ARN. Des échantillons de moelle épinière, de rein et de foie congelés non fixés ont été extraits sans prétraitement. Les échantillons de tissus ont été perturbés à l’aide d’un pilon motorisé (PelletPestle, Kontes, Vineland, NJ) et l’ARN a été extrait à l’aide du réactif Trizol ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) ou de mini colonnes de spin RNea-sy™ (QIAgen), selon les instructions du fabricant. La réaction en chaîne transcriptase-polymérase imbriquée inverse (rtnPCR) a été réalisée en utilisant les amorces imbriquées et une modification de la méthode décrite par Johnson et al., 12 avec des kits de réactifs commerciaux (OneStep™ RT PCR, Qiagen, Valencia, CA et Taq SuperPak ™, Sigma, St. Louis, MO). Le contrôle positif était un 1 : dilution de 1 000 ARN groupés extraits de tissus aviaires positifs au VNO non fixés (principalement des reins et du cerveau). Des bandes d’ADN ont été détectées après électrophorèse sur gel d’agarose à l’aide de GelStar (Cambrex, East Rutherford, NJ). Trois des cinq morceaux de moelle fixe au formol étaient positifs sur rtnPCR, alors que tous les autres échantillons de cerveau fixe (cortex cérébral, cervelet et tronc cérébral) et de moelle épinière, de rein et de foie non fixés (gelés) étaient négatifs.

L’immunohistochimie (IHC) a été réalisée pour tenter de démontrer l’antigène du VNO. Des sections de tissus fixés au formol et incorporés à la paraffine (FFPE) ont été découpées à 5 µm et colorées à l’aide d’un autostainer (Dako, Carpinteria, CA) et de réactifs de détection de la peroxydase de streptavidine-biotine-raifort préemballés (LSAB2, Dako), conformément aux instructions du fabricant. Des sections du cerveau, des reins, du pancréas, du foie, du cœur, de la rate, de la glande surrénale et de la langue ont été colorées à l’aide d’anticorps polyclonaux murins contre le VNO (VR-1267-AF, ATCC, Manassas, VA) après un prétraitement à la protéinase K (Dako). Cet anticorps polyclonal a montré une coloration de fond diffuse modérée dans tous les tissus, ce qui complique l’interprétation. Aucune coloration spécifique n’a été observée, sauf peut-être dans le cerveau où les neurones présentaient de manière diffuse une coloration cytoplasmique légère uniforme par rapport aux lames témoins colorées avec une IgG1 monoclonale non pertinente. Les résultats ont été considérés comme équivoques en raison de la forte coloration de fond et de la nature diffuse de la coloration neuronale, avec peu de variation d’intensité. Ces résultats suggèrent une pénurie d’antigène dans le cerveau du chien, par rapport aux tissus aviaires infectés où une coloration cytoplasmique robuste a été observée.

Des coupes cérébrales ont également été colorées à l’aide d’anticorps monoclonaux contre la nucléoprotéine du virus de la maladie de Carré canine (CDV-NP, VMRD, Pullman, WA), avec des résultats négatifs. L’IHC sur le cerveau FFPE pour le virus de la rage a été réalisée dans un autre laboratoire (Prairie Diagnostic Service, Saskatoon, SK, Canada), avec des résultats négatifs.

Bien que l’encéphalite mortelle due au VNO soit bien documentée chez de nombreuses espèces aviaires, 22 chevaux, 8 et les humains, 20 signes cliniques de maladie causés par ce virus ont rarement été documentés chez le chien. Dans les régions où le VNO est endémique, une prévalence élevée d’anticorps neutralisants spécifiques indique que l’infection chez le chien est fréquente, même si la maladie clinique ne l’est pas. Une enquête sérologique réalisée en Afrique du Sud, où le VNO est endémique, a montré que 37% des chiens présentaient des anticorps neutralisants contre le VNO.5 Une enquête sérologique à New York, immédiatement après la première identification du VNO dans l’hémisphère occidental, a montré qu’un pourcentage plus élevé de chiens (10 %) que de chevaux (3 %) ou d’humains (2,5 %) présentaient des anticorps neutralisants spécifiques près de l’épicentre de l’épidémie (Queens).15 Un rapport précédent d’Afrique du Sud décrivait l’isolement d’un virus, identifié plus tard comme le VNO, du cerveau d’un chien présentant des signes cliniques sévères d’encéphalite.7,21 Dans une expérience, l’infection de trois chiens par le VNO a produit une séroconversion asymptomatique chez les trois virémies, mais mesurable chez un seul de ces animaux, qui a ensuite été révélé souffrir d’hyperadrénocorticisme.5 Une étude plus récente utilisant la souche américaine a démontré une virémie de faible niveau chez les quatre chiens et huit chats infectés,2 sans signes cliniques chez les chiens et seulement une maladie fébrile légère et transitoire chez les chats.

Deux rapports contemporains d’infection sévère au VNO chez des chiens américains ont été publiés. B. et coll. une preuve post-mortem de réplication du VNO dans de nombreux tissus d’un chien de race mixte mâle de 11 ans atteint d’une maladie rénale et du système nerveux central (SNC); la réaction quantitative en chaîne transcriptase inverse–polymérase (RT-PCR) a révélé que les séquences virales étaient les plus abondantes dans les reins, suivies du cœur, du cerveau, des poumons et de la rate.6 Lichtensteiger et coll. décrivez les résultats post-mortem après l’euthanasie d’un chien de race mixte de 8 ans atteint d’une maladie somatique grave comprenant une myocardite, ainsi que d’une encéphalite mortelle du VNO chez un chiot loup de 3 mois.18 Ces deux rapports ont documenté des séquences antigéniques et génétiques du VNO, en utilisant l’IHC et la RT-PCR, respectivement, dans de multiples tissus extraneuraux associés à des lésions de nécrose et d’inflammation.

Ce rapport documente un cas de maladie neurologique sévère chez un chien jeune adulte présentant des signes du SNC d’une durée de 2 semaines, où les signes d’infection par le VNO étaient limités au cerveau. Les lésions histologiques dans le cerveau étaient non spécifiques, mais compatibles avec les résultats d’encéphalite du VNO rapportés chez les chevaux, 8 humains, 20 et les deux rapports chez les chiens, 6, 18, tant en ce qui concerne l’emplacement (tronc cérébral et moelle) que le type (encéphalite non suppurée avec zones de nécrose). Les signes cliniques de perte d’équilibre (roulement) et d’ataxie seraient compatibles avec la maladie cérébellomédullaire, alors que les tremblements du corps entier suggèrent une perturbation plus diffuse du cerveau. Des preuves de méningo-encéphalite ont été trouvées dans le lobe pyriforme et l’hippocampe, le tronc cérébral et le cervelet / moelle, mais ont épargné une grande partie du prosencéphale. La nécrose hépatique dans ce cas sans preuve de réplication virale locale (PCR et IHC négative) était peut-être due à l’hyperthermie récurrente sévère. Les lésions hépatiques dues à une réplication virale antérieure qui a été éliminée au cours de la maladie ne peuvent être exclues bien qu’aucune inflammation n’ait été apparente. De nombreux hépatocytes binucléés ont suggéré des dommages subaiguës avec régénération. La présence de levure Candida dans l’estomac a été considérée comme une découverte fortuite attribuable au traitement antibiotique. Contrastant avec les conclusions de Buckweitz et coll.6 et Lichtensteiger et coll., 18 aucune lésion, aucun acide nucléique viral ou antigène viral n’a été détecté dans aucun tissu extraneural, y compris les reins et le foie congelés et fixes de ce chien.

La zone de nécrose trouvée dans le tronc cérébral de ce chien était associée à une réponse localisée des macrophages (cellules gitter) mais pas à un infiltrat inflammatoire local manifeste suggérant, comme décrit chez les chevaux8, que la lésion peut avoir une étiologie vasculaire ou éventuellement à médiation immunitaire plutôt qu’une étiologie cytolytique ou inflammatoire directe. L’IHC pour le VNO sur le cerveau n’a pas pu démontrer de manière convaincante l’antigène viral dans ce cas et dans le cas rapporté par Buckweitz et al., 6 indiquant des niveaux de réplication virale plus faibles que ceux observés dans les tissus aviaires, encore une fois similaires aux résultats observés chez les chevaux.12 Lichtensteiger et coll.18 n’a pas signalé l’IHC du cerveau.

Le taux relativement plus élevé de maladies neurologiques observées dans les infections équines avec la souche américaine du VNO par rapport à celles en Italie8 est corroboré par des études expérimentales chez la souris, qui indiquent que la souche américaine est très neuroinvasive par rapport à d’autres souches.3 D’autres études chez la souris ont démontré que l’exposition à des anesthésiques gazeux et au CO2 augmente la neuroinvasion du VNO d’une manière dépendante de la concentration et du temps 4,13 suggérant que d’autres facteurs environnementaux ou hôtes peuvent influencer le développement de maladies neurologiques chez les animaux. La faible incidence de la maladie clinique observée chez les chiens face à une séroprévalence élevée suggère que les chiens sont plus résistants à la neuroinvasion que les humains ou les chevaux.

Aucun signe d’infection extraneurale n’a été trouvé chez les chevaux atteints d’encéphalomyélite du VNO 8 comme chez ce chien. Peut-être que chez ce Terrier maltais, la réponse immunitaire avait éliminé le virus des tissus extraneuraux. La présence d’une réplication virale abondante dans les tissus extraneuraux dans les deux autres rapports d’infections canines américaines suggère qu’une certaine réplication virale se produit dans les tissus extraneuraux avant la neuroinvasion et que le rein et le cœur sont probablement des tissus cibles chez le chien. B. et coll.6 suggèrent une biopsie rénale pour le diagnostic d’infection par le VNO chez le chien, mais Lichtensteiger et al.18 n’a trouvé aucun antigène viral dans le rein du chien qu’ils ont examiné. La valeur clinique de la biopsie rénale18 ou même du dépistage du VNO dans l’urine, vraisemblablement par RT-PCR, n’a pas encore été évaluée de manière critique.

La réplication extraneurale du VNO chez l’homme peut être extrapolée à partir de rapports d’encéphalite mortelle chez des receveurs de reins provenant de donneurs infectés qui ont commencé 13 à 18 jours après la transplantation et d’encéphalite sévère chez un receveur de cardiaque9,11 indiquant que la maladie peut être transmise par transplantation de sang ou d’organes. D’autres preuves de réplication robuste du VNO dans les tissus extraneuraux des mammifères sont présentées dans un rapport récent documentant une infection mortelle par le VNO chez trois écureuils du Renard de l’Est, avec des preuves de réplication virale rénale, cérébrale, cardiaque, hépatique et pulmonaire.14 Études supplémentaires sont nécessaires pour élucider les détails de la biologie et de la physiopathologie des infections par le VNO chez les mammifères.

L’importance continue du VNO pour la santé animale et humaine dans ce pays impliquera probablement que le virus devienne endémique avec des épidémies sporadiques. Les agences de santé publique fournissent souvent des informations opportunes sur les éclosions de maladies humaines. Il est possible que l’analyse des anticorps dirigés contre le VNO dans les sérums canins et félins fournisse de précieuses informations épidémiologiques sur la propagation et l’incidence du VNO.