Nach der Einführung eines besonders neuroinvasiven und virulenten Stammes des West-Nil-Virus (WNV) in den Nordosten der Vereinigten Staaten kam es zu einem dramatischen Ausbruch tödlicher Infektionen bei Vögeln, begleitet von einer viel geringeren, aber alarmierenden Anzahl tödlicher Infektionen bei Pferden und Menschen.1,16,17,20,22 Innerhalb von 3 Jahren war das neu eingeführte Flavi-Virus über den nordamerikanischen Kontinent gefegt und hinterließ auf seiner Spur ungezählte Tausende toter Vögel und Tausende bestätigter Krankheitsfälle, darunter Hunderte von Todesfällen bei Pferden und Menschen. Berichte über Morbidität und Mortalität bei anderen Haustieren waren weniger zahlreich. Vogel- und Pferdefälle erreichten 2002 in Mississippi ihren Höhepunkt.

Anfang November 2002 wurde dem überweisenden Tierarzt ein 2-jähriger, kastrierter Malteser Terrier mit einem akuten Beginn eines episodischen, unkontrollierten Rollens vorgestellt, das rasch zu Ganzkörperzittern und Ataxie führte. Die anfängliche Behandlung mit oralem Phenobarbital und einem kurzen Kurs von Prednison ergab eine minimale Verbesserung. Nach dem 1 Woche, Der Fall wurde an das Tiergesundheitszentrum überwiesen, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University, FRAU. Die neurologische Untersuchung zeigte Anzeichen einer Chorea, die aus unwillkürlichen, unregelmäßigen, ruckartigen Zufallsbewegungen des gesamten Körpers bestand. Die Augenkugeln zeigten auch ähnliche unregelmäßige Bewegungen. Die bewusste Propriozeption und die Hüpfreaktionen waren auch in den vorderen Gliedmaßen leicht vermindert. Krankheiten, die unwillkürliche zufällige Bewegungen verursachen, betreffen normalerweise Bereiche der Großhirnrinde oder spezifische extrapyramidale Kerne des Telencephalons oder des Schädelhirnstamms.10 Die Differentialdiagnose umfasste multifokale entzündliche Erkrankungen – infektiös, nicht infektiös und immunvermittelt. Das vollständige Blutbild und die Serumchemie waren unauffällig, und die Analyse der Liquor cerebrospinalis (CSF) ergab keine signifikanten Anomalien. Ein Elektroenzephalogramm zeigte Veränderungen, die auf eine Enzephalitis hindeuteten. Aufgrund klinischer Anzeichen und Elektroenzephalogrammergebnisse wurde der Hund wegen infektiöser Ursachen einer Enzephalitis behandelt. Während des Krankenhausaufenthaltes auf der Intensivstation wurde der Hund sehr erregbar. Die Behandlung mit Doxycyclin, Clindamycin, Diazepam, Diphenhydramin und Flüssigkeiten konnte eine zunehmende Schwere unwillkürlicher Bewegungen und intermittierender Hyperthermie (bis zu 108 F / 42,2 C) nicht verhindern.Die Serologie für Toxoplasma gondii, Neospora caninum (ProtaTek, Chandler, AZ), Ehrlichia canis und Rickettsia rickettsii (Antech, Southaven, MO) war negativ und gepaarte Serum- und Liquortiter für Canine Distemper Virus und Parvovirus (Colorado Veterinary Diagnostic Laboratory, Ft. Collins, CO) zeigte eine schützende Immunität an, konnte jedoch keine intrathekale Antikörperproduktion nachweisen. Nach 6 Tagen Krankenhausaufenthalt und Behandlung, etwa 2 Wochen nach Auftreten der klinischen Symptome, wurde der Hund wegen seines sich verschlechternden Zustands eingeschläfert.

Die Nekropsieuntersuchung ergab keine groben Anomalien. Die mikroskopische Untersuchung des Gehirns ergab eine milde, multifokale, nicht suppurative Meningoenzephalitis, an der graue Substanz oder gemischte Bereiche der grauen / weißen Substanz wie der Hirnstamm beteiligt waren. Dies war durch kleine perivaskuläre Konzentrationen von Lymphozyten innerhalb des Parenchyms und manchmal der angrenzenden Leptomeningen gekennzeichnet. Eine leichte Mikrogliose des Neuropils begleitete häufig die perivaskuläre Manschette (Abb. 1). Entzündungsherde, die manchmal bilateral waren, waren im pyriformen Lappen und im assoziierten Gyrus Parahippocampus und Hippocampus, im Pons und in der Medulla sowie im Kleinhirnkortex vorhanden. Eine einzigartige Läsion nahe der Mittellinie der Medulla Raphe auf Höhe der Olivenkerne bestand aus einem Nekrosebereich mit Fibrinerguss und Blutung, Makrophagenclustern (Gitterzellen) und vielen geschwollenen Axonen (Sphäroiden) mit ein paar kleinen Lymphozytenmanschetten in der Nähe (Abb. 2). Sphäroide wurden nach der Bielschowsky-Methode für Axone positiv gefärbt.19 Die einzigen anderen signifikanten Befunde beschränkten sich auf die Leber, die eine lückenhafte Individualisierung von Hepatozyten, zytoplasmatische Eosinophilie, Kernpyknose und Lyse von Hepatozyten (akute diffuse moderate Lebernekrose) mit zahlreichen zweikernigen Hepatozyten und ohne signifikante entzündliche Zellinfiltration zeigte. Zahlreiche Knospenhefe mit pseudohyphae (Candida sp.) waren im Magenschleim ohne Anzeichen einer Schleimhautinvasion oder Entzündung vorhanden.

Abb. 1. Großhirn; Hund. Verstreute kleine perivaskuläre Manschetten von mononukleären Entzündungszellen und leichte Mikrogliose im pyriformen Lappen. ER Fleck. Stange = 35 µm.

Abb. 2. Medulla oblongata; Hund. Ein Bereich an der Mittellinie Raphe der Medulla, der viele geschwollene Axone (Sphäroide) zeigt, die durch Pfeile angedeutet sind und einen Bereich der Nekrose mit Blutungen und Makrophagen umgeben. ER Fleck. Stange = 70 µm.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für WNV wurde an fixiertem Gehirn und unfixiertem Rückenmark, Leber und Niere durchgeführt. Stücke von Formalin-fixiertem Gehirn mit einem Gewicht von 30-100 mg wurden aus der Medulla oblongata in der Nähe der läsionierten Stelle und verschiedenen anderen Stellen im Hirnstamm, der Großhirnrinde und dem Kleinhirn entfernt, mit Wasser gespült und in RNAlater ™ Reagenz (QIAgen, Valencia, CA) für mindestens 1 Stunde vor der RNA-Extraktion. Proben von gefrorenem, nicht fixiertem Rückenmark, Niere und Leber wurden ohne Vorverarbeitung extrahiert. Gewebeproben wurden mit einem motorgetriebenen Stößel (PelletPestle, Kontes, Vineland, NJ) aufgeschlossen und RNA wurde mit Trizol ™ -Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA) oder RNea-sy ™ Mini-Spin-Säulen (QIAgen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die reverse Transkriptase-Nested-Polymerase-Kettenreaktion (rtnPCR) wurde unter Verwendung der Nested Primer und einer Modifikation des von Johnson et al.,12 mit handelsüblichen Reagenzien-Kits (OneStep™ RT PCR, Qiagen, Valencia, CA, und Taq SuperPak™, Sigma, St. Louis, MO). Positive Kontrolle war ein 1 : 1.000 Verdünnung gepoolter RNA, extrahiert aus nicht fixiertem WNV-positivem aviärem Gewebe (vorwiegend Niere und Gehirn). DNA-Banden wurden nach Agarosegelelektrophorese mit GelStar (Cambrex, East Rutherford, NJ) nachgewiesen. Drei von fünf Stücken von Formalin-fixierten Medulla waren positiv auf rtnPCR, während alle anderen Proben von festen Gehirn (Großhirnrinde, Kleinhirn und Hirnstamm) und unfixiert (gefroren) Rückenmark, Niere und Leber waren negativ.

Immunhistochemie (IHC) wurde durchgeführt, um WNV-Antigen zu demonstrieren. Schnitte von formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Geweben wurden bei 5 µm geschnitten und mit einem Autostainer (Dako, Carpinteria, CA) und vorverpackten Streptavidin–Biotin–Meerrettich-Peroxidase-Nachweisreagenzien (LSAB2, Dako) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt. Schnitte von Gehirn, Niere, Bauchspeicheldrüse, Leber, Herz, Milz, Nebenniere und Zunge wurden mit murinen polyklonalen Antikörpern für WNV (VR-1267-AF, ATCC, Manassas, VA) nach Vorbehandlung mit Proteinase K (Dako) gefärbt. Dieser polyklonale Antikörper zeigte eine moderate diffuse Hintergrundfärbung in allen Geweben, was die Interpretation erschwerte. Es wurde keine spezifische Färbung beobachtet, außer möglicherweise im Gehirn, wo Neuronen diffus eine zytoplasmatische Färbung mit gleichmäßigem Licht zeigten, verglichen mit Kontrollobjekten, die mit irrelevantem monoklonalem IgG1 gefärbt waren. Die Ergebnisse wurden aufgrund der hohen Hintergrundfärbung und der diffusen Natur der neuronalen Färbung mit geringen Intensitätsschwankungen als zweideutig angesehen. Diese Ergebnisse deuteten auf einen Mangel an Antigen im Gehirn des Hundes hin, verglichen mit infizierten Vogelgeweben, bei denen eine robuste zytoplasmatische Färbung beobachtet wurde.

Hirnschnitte wurden auch mit monoklonalen Antikörpern gegen Canine distemper Virus Nucleoprotein (CDV-NP, VMRD, Pullman, WA) mit negativen Ergebnissen gefärbt. IHC auf FFPE Gehirn für Tollwut-Virus wurde in einem anderen Labor durchgeführt (Prairie Diagnostic Service, Saskatoon, SK, Kanada), mit negativen Ergebnissen.Obwohl die tödliche Enzephalitis aufgrund von WNV bei vielen Vogelarten, 22 Pferden, 8 und Menschen, gut dokumentiert ist, wurden 20 klinische Anzeichen einer durch dieses Virus verursachten Krankheit bei Hunden selten dokumentiert. In Gebieten, in denen WNV endemisch ist, weist eine hohe Prävalenz spezifischer neutralisierender Antikörper darauf hin, dass eine Infektion bei Hunden häufig ist, auch wenn dies keine klinische Erkrankung ist. Eine Serobefragung aus Südafrika, wo WNV endemisch ist, zeigte, dass 37% der Hunde neutralisierende Antikörper gegen WNV hatten.5 Eine Serobefragung in New York City unmittelbar nach der ersten Identifizierung von WNV in der westlichen Hemisphäre zeigte, dass ein höherer Prozentsatz von Hunden (10%) als Pferde (3%) oder Menschen (2, 5%) spezifische neutralisierende Antikörper in der Nähe des Epizentrums des Ausbruchs (Queens).15 Ein früherer Bericht aus Südafrika beschrieb die Isolierung eines Virus, das später als WNV identifiziert wurde, aus dem Gehirn eines Hundes mit schweren klinischen Anzeichen einer Enzephalitis.7,21 In einem Experiment führte die Infektion von drei Hunden mit WNV bei allen drei zu einer asymptomatischen Serokonversion, aber nur bei einem dieser Tiere zu einer messbaren Virämie, bei der später festgestellt wurde, dass sie an Hyperadrenokortizismus litt.5 Eine neuere Studie mit dem US-Stamm zeigte bei allen vier infizierten Hunden und acht infizierten Katzen eine niedrige Virämie 2 ohne klinische Anzeichen bei Hunden und nur eine leichte, vorübergehende fieberhafte Erkrankung bei Katzen.

Zwei aktuelle Berichte über schwere WNV-Infektionen bei US-Hunden wurden veröffentlicht. Buckweitz et al. postmortaler Nachweis der WNV-Replikation in vielen Geweben eines 11-jährigen, männlichen Mischlingshundes mit Nieren- und Zentralnervensystemerkrankung (ZNS); quantitative reverse Transkriptase–Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ergab, dass virale Sequenzen in der Niere am häufigsten vorkamen, gefolgt von Herz, Gehirn, Lunge und Milz.6 Lichtensteiger et al. beschreiben Sie postmortale Befunde nach der Euthanatisierung eines 8-jährigen Mischlingshundes mit schwerer somatischer Erkrankung, die Myokarditis sowie tödliche WNV-Enzephalitis bei einem 3 Monate alten Wolfswelpen beinhaltete.18 Beide Berichte dokumentierten Antigen- und genetische Sequenzen von WNV unter Verwendung von IHC bzw. RT-PCR in multiplen extraneuralen Geweben, die mit Läsionen von Nekrose und Entzündung assoziiert waren.Dieser Bericht dokumentiert einen Fall einer schweren neurologischen Erkrankung bei einem jungen erwachsenen Hund mit einer 2-wöchigen Dauer von ZNS-Zeichen, bei dem der Nachweis einer WNV-Infektion auf das Gehirn beschränkt war. Histologische Läsionen im Gehirn waren unspezifisch, aber kompatibel mit Befunden der WNV-Enzephalitis, die bei Pferden,8 Menschen,20 und den beiden Berichten bei Hunden, 6,18 berichtet wurden, sowohl in Bezug auf die Lokalisation (Hirnstamm und Medulla) als auch Typ (nicht-suppurative Enzephalitis mit Nekrosebereichen). Klinische Anzeichen von Gleichgewichtsverlust (Rollen) und Ataxie wären mit einer Kleinhirnerkrankung vereinbar, während Ganzkörperzittern auf eine diffusere Störung des Gehirns hindeuten. Hinweise auf Meningoenzephalitis wurden im pyriformen Lappen und Hippocampus, Hirnstamm und Kleinhirn / Medulla gefunden, verschonten jedoch einen Großteil des Prosencephalons. Eine Lebernekrose in diesem Fall ohne Nachweis einer lokalen Virusreplikation (PCR und IHC negativ) war möglicherweise auf die schwere rezidivierende Hyperthermie zurückzuführen. Leberschäden aufgrund früherer Virusreplikation, die während der Erkrankung beseitigt wurden, können nicht ausgeschlossen werden, obwohl keine Entzündung erkennbar war. Zahlreiche zweikernige Hepatozyten deuteten auf eine subakute Schädigung mit Regeneration hin. Das Vorhandensein von Candida-Hefe im Magen wurde als zufälliger Befund angesehen, der auf die Behandlung mit Antibiotika zurückzuführen ist. Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Buckweitz et al.6 und Lichtensteiger et al.,18 Es wurden keine Läsionen, virale Nukleinsäuren oder virales Antigen in extraneuralen Geweben einschließlich gefrorener und fixierter Nieren und Leber von diesem Hund nachgewiesen.

Der Nekrosebereich im Hirnstamm dieses Hundes war mit einer lokalisierten Makrophagenantwort (Gitterzellen) verbunden, jedoch nicht mit einem offenen lokalen Entzündungsinfiltrat, was darauf hindeutet, wie in Pferde,8 beschrieben, dass die Läsion eher eine vaskuläre oder möglicherweise immunvermittelte Ätiologie als eine direkte zytolytische oder entzündliche Ätiologie aufweisen kann. IHC für WNV am Gehirn konnte in diesem Fall und in dem von Buckweitz et al.,6, der niedrigere Niveaus der Virusreplikation anzeigt, als gesehen, in den Vogelgeweben, wieder ähnlich Befunden in den Pferden.12 Lichtensteiger et al.18 berichtete nicht über IHC des Gehirns.

Die vergleichsweise höhere Rate neurologischer Erkrankungen bei Pferdeinfektionen mit dem US-Stamm von WNV im Vergleich zu denen in Italien8 wird durch experimentelle Studien an Mäusen gestützt, die darauf hindeuten, dass der US-Stamm im Vergleich zu anderen Stämmen stark neuroinvasiv ist.3 Zusätzliche Studien an Mäusen haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber gasförmigen Anästhetika und CO2 die WNV-Neuroinvasion konzentrations- und zeitabhängig erhöht4,13 was darauf hindeutet, dass andere Umwelt- oder Wirtsfaktoren die Entwicklung neurologischer Erkrankungen bei Tieren beeinflussen können. Die geringe Inzidenz klinischer Erkrankungen bei Hunden angesichts einer hohen Seroprävalenz legt nahe, dass Hunde resistenter gegen Neuroinvasion sind als Menschen oder Pferde.

Hinweise auf eine extraneurale Infektion wurden bei Pferden mit WNV-Enzephalomyelitis8 wie bei diesem Hund nicht gefunden. Vielleicht hatte die Immunantwort bei diesem Malteser Terrier das Virus aus extraneuralem Gewebe entfernt. Das Vorhandensein einer reichlichen Virusreplikation in extraneuralen Geweben in den beiden anderen Berichten über US-Hunde-Infektionen legt nahe, dass eine gewisse Virusreplikation in extraneuralen Geweben vor der Neuroinvasion auftritt und dass die Niere und das Herz wahrscheinlich Zielgewebe beim Hund sind. Buckweitz et al.6 schlagen eine Nierenbiopsie zur Diagnose einer WNV-Infektion bei Hunden vor, aber Lichtensteiger et al.18 fanden kein virales Antigen in der Niere des untersuchten Hundes. Der klinische Wert der Nierenbiopsie18 oder sogar Urintests für WNV, vermutlich mit RT-PCR, wurde noch nicht kritisch bewertet.

Die extraneurale Replikation von WNV beim Menschen kann aus Berichten über tödliche Enzephalitis bei Empfängern von Nieren von infizierten Spendern, die 13-18 Tage nach der Transplantation begannen, und von schwerer Enzephalitis bei einem Herzempfänger extrapoliert werden,9,11 Dies deutet darauf hin, dass die Krankheit durch Blut- oder Organtransplantation übertragen werden kann. Weitere Hinweise auf eine robuste WNV-Replikation in extraneuralen Geweben von Säugetieren werden in einem kürzlich veröffentlichten Bericht vorgestellt, der eine tödliche WNV-Infektion bei drei östlichen Fuchshörnchen dokumentiert, mit Hinweisen auf eine renale, zerebrale, kardiale, hepatische und pulmonale Virusreplikation.14 Zusätzliche Studien sind erforderlich, um die Details der Biologie und Pathophysiologie von WNV-Infektionen bei Säugetieren aufzuklären.Die anhaltende Bedeutung von WNV für die Gesundheit von Tier und Mensch in diesem Land wird wahrscheinlich dazu führen, dass das Virus mit sporadischen Ausbrüchen endemisch wird. Öffentliche Gesundheitsbehörden liefern häufig zeitnahe Informationen über Ausbrüche menschlicher Krankheiten. Es ist möglich, dass die Analyse von Antikörpern gegen WNV in Hunde- und Katzenseren wertvolle epidemiologische Informationen über die Ausbreitung und Inzidenz von WNV liefern könnte.