BESCHREIBUNG UND ALLGEMEINE HINWEISE

Restriktionsendonukleasen (REs) sind bakterielle Enzyme, die doppelsträngige DNA spalten. Typ-I-REs sind wichtig für die bakterielle Funktion, spalten jedoch keine DNA an bestimmten Sequenzen. Typ-II-REs, die in diesem Handbuch beschrieben werden, erfordern hochspezifische Stellen für die DNA-Spaltung und sind daher äußerst nützliche Werkzeuge in der Molekularbiologie. Diese Enzyme ermöglichen die Klonierung und Reinigung definierter DNA-Fragmente. Die etwa 500 bekannten REs werden typischerweise aus einer Vielzahl von Bakterienstämmen isoliert.

REs sind in Bakterien vorhanden, die vermutlich DNA aus fremden Quellen zerstören (z. B. Bakteriophagen infizieren), indem sie die fremde DNA an bestimmten Erkennungsstellen spalten. Die DNA der Wirtsbakterien ist vor Spaltung geschützt, da die spezifischen Erkennungsstellen modifiziert werden, üblicherweise durch Methylierung an einer der Basen in der Stelle, wodurch die Stelle nicht mehr ein Substrat für die ERNEUTE Spaltung ist. Praktisch wurden REs mit unterschiedlichen Erkennungsspezifitäten aus verschiedenen Bakterienstämmen gereinigt und werden von Molekularbiologen unter definierten Bedingungen verwendet, um gereinigte DNA aus eukaryotischen Quellen in einer in vitro Reaktion in definierte Fragmente zu spalten. Wirtsbakterien, die zur Vermehrung klonierter DNA im Labor verwendet werden, sind normalerweise in den Wirtsrestriktionsgenen (hsdR, hsdM oder hsdS) mutiert; Daher zerstören ihre intrazellulären Enzymaktivitäten die fremden rekombinanten Sequenzen nicht.

Diese Enden sind komplementär („klebrig“) und können enzymatisch an andere EcoRI-generierte Termini unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gebunden werden. Andere REs erkennen unterschiedliche Sequenzen und machen einzigartige Spaltungen, die zu anderen definierten Termini führen, von denen einige auch 5’hervorstehende Enden, 3′ hervorstehende Enden oder keine hervorstehenden (stumpfen) Enden haben (siehe Tabelle 5.1). Jedes RE hat eine spezifische Sequenz und Anzahl von Nukleotiden, die erforderlich sind, um die Erkennungsstelle zu erstellen. Einige REs erfordern nicht an jeder Position der Erkennungsstelle ein spezifisches Nukleotid. Beispielsweise ist in einigen Fällen ein Purinnukleotid (A oder G) in einer definierten Position ausreichend. Die Häufigkeit, mit der ein RE DNA schneidet, hängt somit von der Anzahl der Basen in den Erkennungssequenzen (wenn mehr Basen benötigt werden, sind weniger Schnitte möglich) und den spezifischen Basen in jeder Position ab.

REs sind nützlich, weil ihre Spezifität und die daraus resultierenden ligierbaren Termini die Dissektion, Analyse und Umstrukturierung von DNA auf kontrollierte, vorhersehbare und ortsspezifische Weise ermöglichen. Da es sich um Enzyme handelt, hat jedes spezifische Anforderungen an Bedingungen, die zu einer optimalen Spaltaktivität führen. Glücklicherweise sind viele unter ähnlichen Bedingungen aktiv, wobei die primäre Variable die Ionenstärke ist (d. H. NaCl im Puffer). Es wurden empirisch praktische Bedingungen für die Verwendung jedes RE als Forschungsinstrument definiert.

Die Menge der RE-Aktivität wird normalerweise nicht mit der klassischen Enzymkinetik definiert. Vielmehr ist die RE-Aktivität für den Einsatz im Labor praktisch definiert. Eine Einheit (U) der Aktivität für eine RE ist normalerweise definiert als die Menge an Enzym, die 1 µg an allen spezifischen Stellen in einer DNA-Probe (normalerweise Bakteriophage λ) in 1 Stunde bei 37 ° C schneidet. Die tatsächlich erreichte Aktivität kann unterschiedlich sein, wenn zusätzliche RE-Aufschlussstellen vorhanden sind. Wenn beispielsweise 1 U eines RE ausreicht, um 1 µg Bakteriophagen λ-DNA an einer Stelle unter Standardtestbedingungen vollständig zu schneiden, kann es nicht möglich sein, 1 µg einer DNA-Probe, die vier Stellen für ein RE aufweist, vollständig zu schneiden, oder eine Probe, die nicht ausreichend gereinigt wurde.

Andere Faktoren, die die Reaktionsbedingungen betreffen, beeinflussen ebenfalls die RE-Aktivität. Dazu gehören die Reinheit der DNA, Puffer, Temperaturbedingungen und die RE selbst. DNA-Methylierung, gebundenes Protein oder übermäßige Viskosität von hochmolekularer DNA in viskosen Lösungen können die Effizienz eines RE-Digest verringern. Die zu schneidende DNA sollte normalerweise frei von Verunreinigungen sein; SS-Phenol / Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung (Abschnitt 20-1) entfernen viele störende Verunreinigungen. Im Gegensatz dazu werden die meisten REs normalerweise nicht durch RNA oder einzelsträngige DNA beeinträchtigt. Daher kann die Zugabe von tRNA als Kopräzipitant nützlich sein, um kleine Mengen DNA zurückzugewinnen, ohne nachfolgende Wiederverdauungen zu beeinflussen.

Die typische Testbedingung für eine RE-Reaktion enthält einen Puffer (10 mM Tris, pH 7,4 ist üblich), 10 mM Mg2+ und ist frei von wesentlichen Konzentrationen an Chelatbildnern (TE-Puffer enthält eine ausreichend geringe Menge an EDTA). Die RE-Puffer enthalten auch geeignete Salzkonzentrationen, um die optimale Ionenstärke für jedes RE zu erhalten. In einigen Fällen werden BSA, DTT und Spermidin zugesetzt, um eine optimale Enzymaktivität bereitzustellen. Vier verallgemeinerte RE-Puffer können die Anforderungen für die meisten REs erfüllen, und die Vorausvorbereitung von 10 × Beständen dieser Puffer wird nachstehend beschrieben. Die meisten RE-Digests werden bei 37 ° C durchgeführt, obwohl es einige Ausnahmen gibt, wie z. B. TaqI.

Die meisten gekauften REs werden mit einem geeigneten Lagerpuffer geliefert, dieser enthält jedoch 25-50% Glycerin, um ein Einfrieren während der Lagerung bei -20 ° C zu verhindern. Glycerinkonzentrationen von über 5% (vol / vol) in RE-Aufschluss-Assays können die Aktivität vieler REs hemmen. Darüber hinaus können hohe Glycerinkonzentrationen während des RE-Aufschlusses die Sequenzspezifität einiger REs entspannen, was zu falschen Spaltungen führt. Zum Beispiel wird dieses Phänomen mit dem allgemein verwendeten RE EcoRI gesehen, wo die unechte Aktivität, die unter einigen Bedingungen beobachtet wird, EcoRI * (Stern) Aktivität genannt wird. Aus diesen Gründen ist es wichtig, das Volumen der RE-Aufschlussreaktion groß genug zu machen, um mindestens eine 1:10-Verdünnung des RE selbst zu umfassen (und somit die Glycerinkonzentration zu reduzieren). Andere Faktoren wie pH-Wert, Ethanol oder unsachgemäße Salzkonzentration können ebenfalls eine erhöhte oder verminderte Aktivität verursachen; Daher ist die sorgfältige Einhaltung der empfohlenen Bedingungen wichtig.

Einige andere Überlegungen sind bei der Verwendung von REs hilfreich. Verwenden Sie bei jeder Übertragung eines RE eine neue Pipettenspitze. Spuren von Verunreinigungen, die dem RE-Vorrat zugesetzt werden, können dessen weitere Verwendung verhindern und die in nachfolgenden Experimenten erzielten Ergebnisse verfälschen. Bei der Optimierung von Reaktionen ist es besser, zusätzliches RE hinzuzufügen, als viel länger als 1 Stunde zu inkubieren. Darüber hinaus ist, wie oben erwähnt, die Enzymaktivität nur zum Schneiden eines DNA-Standards definiert. Da sich Ihre Probe im Allgemeinen stark vom Standard unterscheidet, sollten Sie etwa 2-3 U RE pro Mikrogramm zu schneidender DNA verwenden, insbesondere wenn Sie versuchen, eine schwierige Probe zu verdauen. Es kann manchmal notwendig sein, die Menge an RE zu titrieren, die benötigt wird, um eine DNA-Probe angemessen zu verdauen.

Schließlich, wenn zwei REs verwendet werden sollen, muss auf die optimalen Salzbedingungen von jedem geachtet werden. Wenn beide den gleichen Puffer benötigen, kann der Aufschluss entweder gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Wenn andere Salzbedingungen erforderlich sind, muss zuerst die Lösung verwendet werden, die weniger Salz benötigt. Nach inkubation einstellen die salz zustand, und verdauen mit die RE erfordern hohe salz. RE-Aktivität kann in allen Fällen durch SS-Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt werden. Einige REs sind thermolabil und können durch Erhitzen auf 70 ° C für 5 min inaktiviert werden. Diese Eigenschaft variiert jedoch von einem RE zum nächsten und sollte für jeden verwendeten RE überprüft werden.