Genexpressionsbasierte Dekonvolution von Fettgewebeproben unter Verwendung der AT21-Signaturmatrix

Die AT21-Signaturmatrix wurde mit dem Ziel entwickelt, die zelluläre Zusammensetzung von Fettgewebeproben zu bestimmen. Es besteht aus zelltypspezifischen Expressionsprofilen von 1872 Microarray-Sonden aus 21 Zelltypen. Die 1872 Sonden wurden ausgewählt, um die Fähigkeit der Signaturmatrix, zwischen verschiedenen Zelltypen zu unterscheiden, zu optimieren, was sich in der Minimierung der Informationsüberlappung zwischen Zelltypen widerspiegelt (implementiert über eine Minimierung der Bedingungsnummer, siehe ergänzende Methoden).

In Fig. 2A Wir zeigen die Korrelationen der Signaturen zwischen den verschiedenen Zelltypen und zeigen hohe Korrelationen zwischen verwandten Zelltypen wie subkutanen und Perikard-Adipozyten oder mesenchymalen Stamm- / Stromazellen, Chondrozyten, Osteoblasten und adipösen Stamm- / Stromazellen (ASCs). Angesichts dieser hohen Korrelationen zwischen einigen Zelltypen wollten wir die Fähigkeit unseres Ansatzes untersuchen, ähnliche Zelltypen durch die folgenden zwei Strategien zu unterscheiden. Zunächst wenden wir den Dekonvolutionsansatz auf den Referenzdatensatz selbst an, was zu einer klaren Unterscheidung zwischen Zelltypen führt (Abb. 3A) als Positivkontrolle, um nachzuweisen, dass das vorgeschlagene Verfahren tatsächlich reine Zellsignaturen aus dem Referenzdatensatz eindeutig identifizieren kann. Wir zeigen auch in der gleichen Figur (Abb. 3B,C) die normalisierte Expression von konventionellen Markern und Zelltypen prognostizierten Primärmarkern zum Vergleich aus den Zelltypen im Referenzdatensatz. Die Abbildung zeigt den Vergleich in Bezug auf die zelltypspezifische normalisierte Expression konventioneller Marker mit zellspezifisch vorhergesagten Markern für jeden Zelltyp. Zweitens führen wir eine Dekonvolutionsanalyse mit einem Satz von 779 Fettgewebeproben (ergänzende Daten S2) aus vier verschiedenen Fettgewebedepots (SAT, OAT, PAT und EAT) durch und überprüfen, wie gut die Ergebnisse mit der Literatur übereinstimmen. Diese zweite Analyse zeigt, dass die Fettgewebeproben voraussichtlich durchschnittlich 14,5% ASCs aufweisen, während die Summe der drei verwandten Zelltypen (mesenchymale Stamm- / Stromazellen, Osteoblasten und Chondrozyten) im Durchschnitt unter 1% liegt, was unsere Fähigkeit zeigt, zwischen diesen Zelltypen richtig zu unterscheiden (Ergänzende Abb. S4). Darüber hinaus weisen 95% der SAT-Proben einen Perikard-Adipozyten-Score von 0% und einen durchschnittlichen subkutanen Adipozyten-Score von 74% auf, während bei OAT-, EAT- und PAT-Proben meistens mehr Perikard-Adipozyten als subkutane Adipozyten vorhergesagt werden, obwohl die Unterscheidung weniger klar ist. Dies zeigt den deutlichen Unterschied zwischen subkutanen Adipozyten und Adipozyten aus anderen Fettdepots in der Nähe von inneren Organen, der durch die vorgeschlagene Methodik nachgewiesen werden kann.

Zelltypspezifität von TissueDecoder: Heatmaps der AT21-Signaturmatrix, die (A) die Vorhersage der Zelltypzusammensetzung aus CIBERSORT mit der AT21-Signaturmatrix, (B) die normalisierte Expression ausgewählter konventioneller Marker aus der Literatur und (C) die normalisierte Expression zellbasierter prädizierter Primärmarker. Die gemeinsame Xaxis über der Abbildung kennzeichnet die Proben, die zur Annotation von Zelltypen aus der AT21-Signaturmatrix verwendet werden. CellMaDe und CIBERSORT werden beide mit der AT21-Signaturmatrix trainiert, daher sind (A, C) optimale Ergebnisse für beide Techniken, während (B) die Trennkraft herkömmlicher Marker auf der AT21-Signaturmatrix darstellt. Grüne Kästchen geben für jeden Zelltyp (Spalten) die Zeile mit der entsprechenden Markierung an.

Neben diesen Auswertungen verwendeten wir einen unabhängigen plattformübergreifenden Validierungsdatensatz (verschiedene Affymetrix Microarray-Plattformen), um die CIBERSORT-basierte Dekonvolution mit der AT21-Signaturmatrix zu testen, was zeigt, dass unser Ansatz für alle getesteten Zelltypen im Validierungsdatensatz die höchsten Prozentsätze für den jeweiligen isolierten Zelltyp korrekt liefert (Ergänzende Abb. S1C).

Die mittleren geschätzten Prozentsätze des isolierten Zelltyps betragen 69,2% für subkutane Adipozyten, 57,1% für ASCs, 89,9% für B-Zellen, 84.8% für CD4 + T-Zellen, 71,0% für CD8 + T-Zellen, 62,0% für NK-Zellen und 90,5% für Monozyten. Die CD14 + -Fraktion des Fettgewebes (Monozyten / Makrophagen) wird voraussichtlich hauptsächlich aus Makrophagen (25,4%), myeloischen dendritischen Zellen (24,4%) und Monozyten (18,1%) bestehen. Die Abweichung von den optimalen Ergebnissen basierend auf den Referenzdaten selbst (Abb. 3A) kann durch plattformübergreifende Unterschiede zwischen den Validierungs- und Referenzdatensätzen erklärt werden (Validierungsdatensatz und Referenzdatensatz wurden mit zwei verschiedenen Affymetrix-Microarrays hybridisiert).

CellMaDe primäre und sekundäre Marker

Als nächstes charakterisieren wir die Signaturmatrix weiter, indem wir untersuchen, welche Gene darin enthalten sind, und indem wir ihre Zelltypspezifität mit der herkömmlich verwendeter Zelltypmarker anhand der primären und sekundären Markerkriterien (Eqs. 1 und 2 im Abschnitt Methoden). Dies hat zu einer Rangfolge aller auf dem Array vorhandenen Sonden nach ihren primären und sekundären Kriteriumswerten geführt. In Fig. 2B zeigen wir die Top 10 Gene mit dem höchsten primären und sekundären Kriteriumswert aus vier Zelltypen – nämlich ASCs, CD8 + T-Zellen, Makrophagen und subkutanen Adipozyten – und geben ihre zelluläre Position gemäß den Begriffen der Genontologie an (für alle 21 Zelltypen siehe Ergänzende Abb. S2, Ergänzende Daten S3). Alle Gene, die in der AT21-Signaturmatrix vorhanden sind, sind fett markiert, was zeigt, dass der CIBERSORT-Algorithmus hauptsächlich eine Kombination von Sekundärmarkern auswählt (CIBERSORTS Genauswahlkriterium ist vergleichbar mit unserem Sekundärmarkerkriterium), während Primärmarker und konventionelle Marker nicht immer in der Signaturmatrix enthalten sind.Dies steht im Gegensatz zu klassischen markerbasierten Ansätzen wie der Immunhistochemie, die stark auf die Zelltypspezifität eines einzelnen (primären) Markers angewiesen sind. Dennoch werden herkömmliche Marker wie CD68 für Makrophagen auch in anderen Zelltypen, wie Monozyten, plasmazytoiden dendritischen Zellen10 und in geringerem Maße auch in Fibroblasten und Endothelzellen11,12 exprimiert, was auch durch seinen relativ niedrigen Primärkriterium-Score angezeigt wird (Abb. 2B). Wir schlagen daher vor, die von CellMaDe identifizierten Primärmarker experimentell weiter zu bestätigen, bevor sie als alternative Marker für die Zelltypen innerhalb des Fettgewebes geklärt werden.

Für CD8+ T-Zellen wird der konventionell verwendete Marker (Differenzierungscluster 8B; CD8B) wird als stärkster Primärmarker identifiziert, was nicht sehr überraschend war. Cluster of Differentiation 4 (CD4) ist jedoch nicht sehr spezifisch für CD4 + T-Zellen, wie seine vorherrschende Expression in anderen hämatopoetischen Zelltypen wie Monozyten oder Makrophagen zeigt (Abb. 3B, Ergänzend Fig. S2). Dies ist auch der Grund dafür, dass in der Durchflusszytometrie CD4 erst nach der Identifizierung der CD3 + -Zellpopulation (T-Zellen) zur Identifizierung von CD4 + -T-Zellen verwendet wird. Das Dendrozyten-exprimierte Seven-Transmembrane-Protein (DCSTAMP) wird nach unserer Analyse als sehr spezifischer Primärmarker für Makrophagen identifiziert. In Fig. 3C wir beobachten, dass die hohe Expression von DCSTAMP auf eine Teilmenge der Makrophagenproben beschränkt ist, was seine Spezifität für eine Teilmenge von Makrophagen, z. B. Makrophagenriesenzellen, hervorheben könnte, wie frühere Studien nahelegen13. Für ASCs ist der identifizierte Primärmarker EEA1 nicht sehr auffällig. Für diesen Zelltyp empfehlen wir die Verwendung einer Kombination von Sekundärmarkern, wie sie in Durchflusszytometrie-Gating-Strategien sowie im CIBERSORT-Algorithmus implementiert sind.

Der Fall der subkutanen Adipozyten scheint ähnlich zu sein, da der Primärmarker CMA1 ebenfalls nicht sehr auffällig ist. Dies ist jedoch darauf zurückzuführen, dass auch Perikard-Adipozyten Teil der Referenzmatrix sind. Daher liegt das Hauptkriterium in diesem Fall nicht nur auf der Unterscheidung von Adipozyten von anderen Zelltypen, sondern auch auf der Unterscheidung von Adipozyten von zwei verschiedenen Depots. Daher schlossen wir eine zusätzliche Analyse ein, indem wir alle Adipozyten in der Referenzmatrix zusammenführten, um primäre Marker für Adipozyten zu bestimmen. Die drei wichtigsten primären Marker, die in dieser Analyse für Adipozyten identifiziert wurden, waren SPARCL1, ADIPOQ und THRSP.

Zur weiteren Auswertung der identifizierten Top-Primärmarker verglichen wir ihre Expression in einem umfangreicheren unabhängigen Datensatz, der aus 394 anatomisch annotierten Gewebeexpressionsprofilen besteht (Ergänzende Abb. S3, Ergänzende Methoden). Sechs der 21 primären Marker sind vollständig validiert und zeigen die höchste Expression im vorgeschlagenen Zelltyp, nämlich CALCRL für Endothelzellen, SPTA1 für Erythroblasten, CD8B für CD8 + T-Zellen, MS4A1 für B-Zellen, PRSS33 für Eosinophile und DCSTAMP für Makrophagen. Zwölf Marker sind teilweise validiert, identifiziert als unter den Top fünf der 394 anatomisch annotierten Gewebeexpressionsprofile oder auf einer höheren Ebene nur in Zelltypen exprimiert, die nicht mit Fettgewebe verwandt sind, wie Myozyten oder Neuronen. Nur drei Marker wurden nicht validiert, nämlich EEA1 für ASCs, RGS5 für glatte Muskelzellen und PF4V1 für Thrombozyten, letzteres aufgrund des Fehlens von Thrombozyten im Validierungsdatensatz für PF4V1, was seine ordnungsgemäße Bewertung verhindert.

Schließlich haben wir den unabhängigen Validierungsdatensatz verwendet, um die Diskriminierungskraft der identifizierten Top-Primärmarker zu bewerten. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in ergänzender Abb. S1 und ergänzende Daten S2, die zeigen, dass die primären Marker exprimiert werden und in der Lage sind, zwischen Zelltypen im Validierungsdatensatz zu unterscheiden, mit Ausnahme von CMA1 für subkutane Adipozyten und EEA1 für ASCs (Ergänzende Abb. S1B).

Kontextualisierung der Befunde – eine Literaturübersicht

Im nächsten Schritt der Auswertung haben wir quantitative Literaturberichte zur Zusammensetzung des Zelltyps des menschlichen Fettgewebes zusammengestellt, um die Schätzungen unseres Dekonvolutionsansatzes für 1119 SAT-Proben (616 Microarray- und 503 RNA-Seq-Datensätze) und 51 OAT-Proben mit den in der Literatur angegebenen Prozentsätzen zu vergleichen.

Zuerst suchten wir nach Berichten in der Literatur, die den Prozentsatz der Adipozyten im Fettgewebe quantifizierten. Diese Suche ergab eine Reihe von Schätzungen von ~ 93% 14, ~ 70% 15,16 und ~ 15% 17, die möglicherweise durch Unterschiede in der Probenverarbeitung (z. B. Entfernung von Blutgefäßen) und Zählmethoden (z. B. Histologie vs. Zellisolierung, verschiedene Marker) erklärt werden können. Vor kurzem schätzten Glastonbury und Kollegen die Adipozytenfraktion in zwei RNA-Seq-Datensätzen auf Populationsebene (TwinsUK, n = 766 und das Genotype-Tissue Expression Project, n = 326), indem sie die relativen Anteile von vier verschiedenen Zelltypen schätzten (Adipozyten, Makrophagen, CD4 + T-Zellen und mikrovaskuläre Endothelzellen). Ihre Schätzung für den mittleren Prozentsatz der Adipozyten beträgt 62% für die GTEx- und 82% TwinsUK-Studie18.

Anschließend konzentrierten wir uns auf Studien zur Bestimmung von Fraktionen von Nicht-Adipozyten19 und nahmen 25 Originalstudien in unseren Review auf. Die quantitativen Ergebnisse der aus diesen Studien extrahierten Zellfraktionen sind in Abb. 4 und ergänzende Daten S4 (siehe Ergänzende Methoden für methodische Details). Die gemeldeten Zellzahlen für Makrophagen variieren stark und reichen von durchschnittlichen Zahlen von weniger als 1% der Gesamtzellen in einigen Studien bis zu durchschnittlich 27% der Gesamtzellen in einer anderen Studie. Diese relativ großen Unterschiede zwischen den Studien können auf verschiedene Faktoren zurückzuführen sein, darunter (i) tatsächliche biologische Unterschiede zwischen den analysierten Proben, (ii) lokale Anreicherung von Makrophagen (z. b. in kronenartigen Strukturen), die Ergebnisse mit niedrigen Gesamtzellzahlen wie Immunhistochemie spezifisch beeinflussen, (iii) technische Unterschiede zwischen den verwendeten Methoden und Markern und (iv) Unterschiede in der Probenhandhabung und Analyseprotokollen (z. B. Fluoreszenz-Cutoffs, verwendete Antikörper). Es ist wichtig zu beachten, dass insbesondere einige immunhistochemische Studien sehr hohe Makrophagenzahlen melden (Abb. 4A). Darüber hinaus kann es einige Unterschiede aufgrund der gemeldeten Einheiten in verschiedenen Studien geben, da die beiden Studien mit den höchsten Makrophagenanteilen (Durchschnittswerte von 27% und 26% Makrophagen) die einzigen sind, die in Makrophagen pro Gesamtzahl der Kerne angegeben werden. Wir haben zuvor gezeigt, dass immunhistochemische Studien aus Gewebeschnitten aufgrund der Abhängigkeit von Beobachtungen aus Querschnitten (dünnen Gewebeschnitten) voreingenommen sein können 20. Daher kann argumentiert werden, dass der Querschnitt speziell für Adipozyten Teile des Lipidtröpfchens abdecken kann, nicht jedoch den Kern, was zu systematischen Unterschieden zwischen den Zählmethoden führt.

Überprüfung der zellulären Zusammensetzung des Fettgewebes: Literaturübersicht der gemeldeten zellulären Zusammensetzung des Fettgewebes im Vergleich zu unseren Ergebnissen mit CIBERSORT (in grün). Dargestellt ist der mittlere (Punkte), minimale und maximale (Pfeile) Prozentsatz der Gesamtzellen (berechnet nach Annahmen und Formeln, die in den ergänzenden Methoden angegeben sind) für fünf verschiedene Zelltypen – Makrophagen (A), ASCs (B), CD4 + T-Zellen (C), CD8 + T-Zellen (D) und Endothelzellen (E). Die Farbe gibt die Methode an, die für die Zellenzählung verwendet wird, wie in der Legende angegeben. Die grauen Punkte und Pfeile in (A) sind unsere Ergebnisse, bei denen der Makrophagen-Score und der Monozyten-Score addiert wurden. Es wird als Vergleich gezeigt, da die Makrophagenmarker CD68, CD56 und CD14 auch Monozyten färben. Der graue Punkt in (B) repräsentiert die Summe der ’supra adventitial-adipösen Stromazellen‘ (schwarzer Punkt in der gleichen Reihe) und ‚endothelialen Vorläuferzellen‘, die in der jeweiligen Studie unterschieden wurden, aber wahrscheinlich beide im ‚adipösen Stamm / Stromazelle‘ -Score aus unserer AT21-Signaturmatrix abgedeckt sind. Auf der linken Seite jedes Diagramms sind die Verweise auf die Studien, aus denen die Ergebnisse entnommen wurden (siehe ergänzende Daten S4), und die verwendeten Marker angegeben. Für ASCs und Endothelzellen wurde eine Kombination von Markern verwendet (siehe Ergänzende Daten S4). Ein Stern, der dem Studienreferenzschreiben beigefügt ist, zeigt an, dass der Studienteilnehmer einen durchschnittlichen Body-Mass-Index über 35 hatte. Es ist in der Abbildung enthalten, da berichtet wurde, dass die Makrophagenhäufigkeit bei Menschen mit schwerer Fettleibigkeit erhöht ist.

Um den möglichen Einfluss biologischer Unterschiede zwischen den Studienteilnehmern, insbesondere in Bezug auf ihren Adipositas-Status, zu bewerten, haben wir alle Studien mit Personen mit einem durchschnittlichen Body-Mass-Index über 35 (schwere Adipositas) mit einem Stern markiert (Abb. 4A). Der Zusammenhang zwischen Adipositas-Status und Makrophagenzahl wurde in mehreren Artikeln untersucht, wobei in einigen, aber nicht in allen Studien eine erhöhte Makrophagenzahl mit zunehmender Adipositas berichtet wurde21,22,23,24,25,26. Nichtsdestotrotz kann der Adipositasstatus die beobachtete Vielfalt zwischen den berichteten Makrophagenprozentsätzen in unserer Literaturübersicht nicht erklären (Abb. 4A).

Zum Vergleich bewerteten wir studieninterne Unterschiede in unseren Analysen (nur SAT) und zeigten relativ stabile Ergebnisse, was auf eine bessere Standardisierung trotz biologischer Unterschiede der Studienteilnehmer und potenzieller Unterschiede im Probenhandling zwischen verschiedenen Labors hinweist (Ergänzende Abb. S5). Selbst die Verwendung von Daten auf RNA-Seq-Ebene zur Durchführung der Dekonvolution führte zu einer geringeren Varianz als die in der Literatur berichteten Studien (Abb. 4, Ergänzend Fig. S6).Im Vergleich zu den Literaturberichten liegt die geschätzte Menge an Makrophagen aus unserer Analyse am unteren Ende des Spektrums, mit einem Durchschnitt von 1,3% der Gesamtzellen für die 616 SAT-Proben (Median von 0,8%, IQR: 0,03% -1,8%) und 1,2% der Gesamtzellen für die 51 OAT-Proben (Median von 1,2%, IQR: 0,4% -1,8%). Mit Blick auf die Extreme bestätigen unsere Ergebnisse, dass es eine große Bandbreite an Makrophagen-Zusammensetzungen mit bis zu 25% Makrophagen in sehr seltenen Fällen gibt.

Um den möglichen Einfluss von Monozyten zu berücksichtigen, die auch die in den Literaturstudien verwendeten Marker (CD14, CD68 und HAM56) exprimieren, berichten wir auch über die kombinierten Fraktionen von Makrophagen und Monozyten aus unserem AT21-CIBERSORT-Ansatz. Dies entspricht einem Durchschnitt von 1,5% Makrophagen / Monozyten in SAT-Proben und 4,3% Makrophagen / Monozyten in OAT-Proben, was unsere Schätzungen in die Nähe der in der Literatur angegebenen Mittelwerte bringt.

Die Menge an ASCs (Mittelwert von 14,8% in SAT und 15,7% in OAT), CD4 + T-Zellen (Mittelwert von 0,9% in SAT und 0.4% in OAT), CD8 + T-Zellen (Mittelwert von 0,5% sowohl in SAT als auch in OAT) und Endothelzellen (Mittelwert von 0,7% in SAT und 1,8% in OAT), die von unserem Ansatz geschätzt werden, stimmen gut mit den Literaturberichten überein (Abb. 4B-E). Ähnlich wie bei Makrophagen zeigen Literaturberichte über ASC-Mengen große Variationen (Abb. 4B). Wir haben drei Gründe identifiziert, die diese Variation erklären. Erstens verwenden drei der Literaturstudien (Studien s, t und v – siehe ergänzende Daten S4) Fettgewebe aus Liposuktionsaspiraten, das mit Blut kontaminiert ist17, was zu niedrigeren relativen Anteilen von ASCs im SVF führt. Zweitens unterscheiden einige Studien zwischen endothelialen Vorläufern und supra-adventitiellen adipösen Stammzellen (z. B. Studien u und v), während andere (einschließlich unserer Studie) dies nicht tun und möglicherweise beide Subpopulationen als ASCs zählen. Bemerkenswert ist, dass bei der Addition der beiden Subpopulationen in der Studie von Zimmerlin27 der resultierende durchschnittliche Anteil von 13,9% (grauer Punkt in Abb. 4B) liegt nahe an unseren geschätzten Ergebnissen. Drittens variieren die Gesamtzellausbeute und der Stamm- / Stromazellprozentsatz stark in Abhängigkeit von der Methode zur Isolierung von SVF28,29, was möglicherweise die von Viardot und Kollegen gemeldeten sehr niedrigen Zahlen erklärt30 (Studie m).

Es gibt verschiedene Zelltypen wie plasmazytoide dendritische Zellen, Neutrophile oder Eosinophile, für die wir in der Literatur keine Ergebnisse finden konnten und daher erstmals ihre Häufigkeit im menschlichen Fettgewebe melden. Einige Zelltypen wie Blutplättchen und Erythroblasten werden hauptsächlich als Kontrolle in die AT21-Signaturmatrix aufgenommen, wodurch das Vorhandensein von Blut in den Proben identifiziert werden kann.

Referenzdatensatz mit aus Fettgewebe isolierten Zelltypen

Zur weiteren Verifizierung der Ergebnisse der AT21-Dekonvolution verglichen wir sie mit der Dekonvolution basierend auf der AT4-Signaturmatrix, die aus vier aus Fettgewebe isolierten Zellfraktionen besteht.

Um Unterschiede in der Studienpopulation und den Gewebeprobenprobenverfahren auszuschließen (unter Beibehaltung der Unterschiede in der Zelltypgranularität, den Referenzproben und der Durchführung plattformübergreifender Analysen), verwendeten wir die Ex-vivo-Referenz, um die 779 Fettgewebeproben aus dem Affymetrix Human U133 Plus 2.0-Array, die wir zuvor mit unserer AT21-Signaturmatrix analysiert hatten, zu dekonvolvieren. Die resultierenden Zellprozentsätze (ergänzende Fig. S7) liegen in einem ähnlichen Bereich wie die mit AT21 als Referenz erhaltenen Ergebnisse (obwohl die Monozyten / Makrophagen-Prozentsätze etwas höher sind) und korrelieren einigermaßen gut mit ihnen, wobei Spearman- und Pearson-Korrelationen zwischen 0,41 und 0,87 (Ergänzende Abb. S8). Dennoch zeigt unsere Analyse, dass die Wahl der Zelltypen und ihrer Herkunft potenzielle Auswirkungen auf den Detaillierungsgrad der Ergebnisse haben kann, obwohl die Gesamtverteilung erhalten bleibt.

Zur weiteren Auswertung unseres Dekonvolutionsansatzes verwendeten wir diese ‚ex-vivo-Referenz‘, um Proben zu dekonvolvieren, die aus der Stromagefäßfraktion von Fettgewebe bestehen (ebenfalls aus dem Datensatz GSE80654), wobei eine Zelltypverteilung von durchschnittlich 53% Stamm- / Stromazellen, 27% Monozyten / Makrophagen, 19% anderen Leukozyten und 1% Adipozyten (siehe Ergänzende Abb. S9) von n = 6 Personen von insgesamt n = 10. Die Daten für die verbleibenden vier Personen waren nicht verfügbar. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten leicht unterschiedliche Durchschnittswerte von 62% Stamm- / Stromazellen, 13% Monozyten / Makrophagen, 12% anderen Leukozyten, 3% Endothelzellen, ~ 10% nicht spezifiziert), obwohl sie aus der größeren Stichprobengröße von n = 10 Personen in der ursprünglichen Studie stammten31. Beide Ergebnisse bestätigen die hohe Menge an Stamm- / Stromazellen im Fettgewebe und sind (nach Umrechnung der Einheiten von Zellen in SVF in Zellen im Fettgewebe – siehe Methoden) unseren durchschnittlichen Ergebnissen bei der Anwendung von AT21 auf Fettgewebe einigermaßen ähnlich, wenn man die Unterschiede in der Studienpopulation, den Methoden zur Probenahme von Fettgewebe und der Granularität der Zelltypunterscheidung (4 vs. 21 Zelltypen) berücksichtigt.

Vergleich von vier Fettgewebedepots

Als nächstes vergleichen wir die Zelltypzusammensetzung von vier Fettgewebedepots (SAT, OAT, PAT und EAT), indem wir ihre durchschnittliche Zelltypzusammensetzung angeben (Abb. 5, in ergänzender Fig. S4). Dies zeigt, dass SAT den höchsten Prozentsatz an Adipozyten aufweist (74%), gefolgt von OAT (66,4%), EAT (59,5%) und PAT (59,4%), während EAT und PAT weit mehr Immunzellen aufweisen (20,8% bzw. 20,9%) im Vergleich zu OAT (9,8%) und SAT (7,4%). Darüber hinaus ist OAT die reichste Quelle für Stammzellen / Stromazellen (17,2% gegenüber 14,9% für SAT, 14.1% für EAT und 12,4% für PAT).

Geschätzter Prozentsatz der Zelltypen pro Fettdepot: (A) Kreisdiagramm mit der Gesamtzelltypverteilung verschiedener Fettgewebedepots (Subkutan – n = 616, Omental – n = 51 , Perikard – n = 66 und Epikard – n = 46) in Bezug auf vier Hauptarchetypen von Zellen im Fettgewebe (Immunzellen, Stammzellen / Stromazellen, Adipozyten und andere). (B) Balkendiagramme, die die detaillierte Verteilung des Immunzellkompartiments aus jedem Fettgewebedepot zeigen. Alle Werte sind Mittelwerte der analysierten Proben aus dem jeweiligen Depot.

Diese Ergebnisse müssen aufgrund der unterschiedlichen Anzahl und Merkmale der Personen, von denen die Proben entnommen wurden, sorgfältig interpretiert werden. Der Zugang zu EAT und PAT ist aufgrund ihrer physiologischen Lage und der Invasivität des Probenahmeverfahrens stark eingeschränkt. Daher wurden Proben von 66 Patienten (Alter: 66 ± 8 Jahre) mit koronarer Herzkrankheit (KHK)32 und die EAT-Proben wurden von 11 Neugeborenen (6 bis 24 Tage alt), 28 Säuglingen (40 Tage bis 1 Jahr alt) und 7 Kindern (2 bis 7 Jahre alt) mit angeborener Herzkrankheit (KHK) 33 entnommen.

Trotz Unterschieden im Alter von EAT- und PAT-Spendern ist die Zusammensetzung des Immunzellen-Archetyps in EAT und PAT bemerkenswert ähnlich und unterscheidet sich stark von SAT- und OAT-Proben. Dies zeigt die Robustheit unserer Ergebnisse sowie die konservierte Natur der Zelltypzusammensetzung in diesen beiden Fettgewebedepots, die das Herz umgeben.

Darüber hinaus berichten wir über die Fraktionen von klassisch bezeichneten „adaptiven“ Immunzellen, einschließlich B-Zellen, CD8 + und CD4+ T-Zellen, die in EAT und PAT infiltriert wurden. Diese adaptiven Immunzellen sind in EAT und PAT angereichert (höher in PAT als in EAT) im Vergleich zu SAT- und OAT-Depots, was wahrscheinlich auf die Herkunft der analysierten Proben von Patienten mit CAD oder KHK zurückzuführen sein könnte, wie bereits für CD8 + T-Zellen berichtet 34. Unser Befund wird auch von Mazurek und Kollegen unterstützt35, die die Expression von Zytokinen in EAT und SAT bei Patienten, die sich einer Koronararterien-Bypass-Transplantation unterziehen, verglichen und festgestellt haben, dass EAT eine Quelle mehrerer Entzündungsmediatoren ist.

Ein detaillierterer Vergleich von SAT und OAT wurde an der Studie von Hardy et al. 2011 (Datensatz GSE20950), in dem beide Depots von denselben Personen verfügbar waren25. Diese Analyse ergab einen erhöhten Neutrophilengehalt in SAT (auch nach Korrektur für Mehrfachtests) und einen erhöhten mesenchymalen Stamm- / Stromazell- und glatten Muskelzellgehalt in OAT (Abb. 6A). Die Untersuchung von CellMaDe-abgeleiteten Markern für Neutrophile (CYP4F3) sowie für Perikard-Adipozyten (C7) und subkutane Adipozyten (CMA1) bestätigte den signifikanten Unterschied zwischen SAT und OAT in diesen Zelltypen (auch nach Anpassung für Mehrfachtests).

Zusammensetzung des Fettgewebes über phänotypische Merkmale: (A) Heatmap, die den signifikanten über (rot) / unter (blau) dargestellten Zelltyp in verschiedenen Kategorien basierend auf dem anzahl der Standardabweichungen jede Gruppe ist von der anderen entfernt). Nur signifikante Ergebnisse (unkorrigiertes p < 0.05) werden eingefärbt. Sterne kennzeichnen Ergebnisse, die nach der Korrektur für mehrere Tests signifikant bleiben. Die Bohnendiagramme zeigen (B) alle signifikanten Zelltypen und (C) ASCs und subkutane Adipozyten (nicht als signifikant nachgewiesen) für die schwerere vs. schlankere Zwillings-, diskordante Studie. Die y-Achse beschreibt Unterschiede in den geschätzten Zellanteilen zwischen dem schwereren und dem schlankeren Zwilling innerhalb eines Zwillingspaares.

Zusammensetzung des Zelltyps über phänotypische Merkmale hinweg

Schließlich verglichen wir die Zusammensetzung des Zelltyps des Fettgewebes zwischen Individuen mit unterschiedlichen phänotypischen Merkmalen, wie z. B. unterschiedlichem Geschlecht, Alter, Body-Mass-Index (BMI) und verschiedenen Stadien der Entwicklung von Typ-2-Diabetes. Darüber hinaus schlossen wir Interventionsstudien ein, die die Wirkung von Kalorienrestriktion oder Resveratrolaufnahme auf die Zusammensetzung des SAT-Zelltyps untersuchen. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in Abb. 6 und in ergänzender Fig. S10 und ergänzende Daten S5.

Wir haben signifikante Unterschiede in der SAT-Zellzusammensetzung zwischen Männern und Frauen festgestellt, was darauf hindeutet, dass es bei Frauen höhere Mengen an plasmazytoiden dendritischen Zellen, CD4 + T-Zellen, Thrombozyten und Chondrozyten gibt, während Männer mehr CD8 + T-Zellen, Fibroblasten und Endothelzellen haben. Bemerkenswerterweise waren die Unterschiede in CD4 + – und CD8 + -T-Zellen auch nach Korrektur für Mehrfachtests signifikant, wurden jedoch nicht anhand einzelner etablierter oder von CellMaDe abgeleiteter Marker nachgewiesen. In Bezug auf das Alter haben wir nur ein signifikantes Ergebnis festgestellt, das auf eine höhere Menge an Fibroblasten mit zunehmendem Alter hinweist.

Wir schließen vier Vergleiche in Bezug auf den BMI ein, nämlich (i) eine kontinuierliche Beziehung des BMI zu Zellfraktionen in SAT, (ii) einen Vergleich der zellulären Zusammensetzung von SAT bei konkordanten eineiigen Zwillingen (schwerer vs. schlanker Zwilling, ∆BMI < 3 kg/m2), (iii) dasselbe bei diskordanten eineiigen Zwillingen (schwerer vs. schlanker Zwilling, ∆BMI > 3 kg/m2) und (iv) ein Vergleich der zellulären Zusammensetzung von HAFER bei adipösen vs. mageren Kindern. Der erste Vergleich zeigt, dass der BMI positiv mit der Menge an Monozyten, myeloischen dendritischen Zellen, Blutplättchen, Osteoblasten, Chondrozyten und ASCs in SAT korreliert, während die Korrelation mit subkutanen Adipozyten negativ ist. Es werden keine signifikanten Unterschiede zwischen konkordanten Zwillingen festgestellt, während sich diskordante Zwillinge signifikant in der Menge an CD4 + -T-Zellen, Erythroblasten, Osteoblasten (alle höher bei schwereren Zwillingen) sowie B-Zellen (höher bei schlankeren Zwillingen) unterscheiden (Abb. 6B). Bemerkenswerterweise besteht eine Tendenz zu höheren Mengen an ASCs und niedrigeren Mengen an Adipozyten bei schwereren Zwillingen (Abb. 6C), was den jeweils signifikanten Befund in der kontinuierlichen Assoziation mit dem BMI unterstützt. Im Gegensatz dazu werden einige andere Befunde der kontinuierlichen Assoziation mit dem BMI in der Zwillingsstudie nicht nachgewiesen, was auf mögliche Störeffekte (Alter, Geschlecht oder andere Faktoren) in der kontinuierlichen Assoziation zurückzuführen ist.

Das Fehlen signifikanter Ergebnisse beim Vergleich von Lean vs. übergewichtige Kinder sind hauptsächlich auf eine begrenzte Leistung zurückzuführen, da die Studie nur insgesamt 11 Proben umfasst (5 fettleibige und 6 magere Kinder).

Wir haben sechs Vergleiche in Bezug auf Diabetes, Glukosetoleranz oder Insulinresistenz durchgeführt. Drei von ihnen (gestörte Glukosetoleranz vs. normale Glukosetoleranz bei SAT; Diabetes mellitus vs. gestörte Glukosetoleranz bei SAT; und insulinresistent vs. empfindlich bei OAT) zeigten keine statistisch signifikanten Ergebnisse. Der Vergleich der Zusammensetzung des SAT-Zelltyps bei insulinresistenten vs. empfindliche Personen zeigten einen signifikanten Anstieg der glatten Muskelzellen bei insulinresistenten Personen. Der SAT von Menschen mit Diabetes mellitus enthält laut unserer Analyse mehr Monozyten und weniger Eosinophile als der von normalen glukosetoleranten Menschen, während der OAT von krankhaft übergewichtigen Menschen Unterschiede in myeloischen dendritischen Zellen, Eosinophilen (beide höher bei Menschen mit Diabetes) und Chondrozyten (höher bei Menschen ohne Diabetes) aufweist.

Wir fanden keine Hinweise darauf, dass eine Kalorienrestriktion oder eine Resveratrol-Supplementierung die Zusammensetzung der Fettgewebszellen signifikant verändert.Interessanterweise berichtet eine eingeschlossene Studie auch über Makrophagenprozentsätze, die durch Immunhistochemie25 (GSE20950) bestimmt wurden. Sie zeigen Makrophagenfrequenzen für 11 Haferproben (von 20 Studienteilnehmern) von insulinsensitiven und insulinresistenten Personen mit einem durchschnittlichen Makrophagengehalt von 1,8% (nach Umrechnung der Einheiten in% der Gesamtzellen), was unserer Schätzung von 1 gut entspricht.495% als Durchschnitt aller 20 Teilnehmer (Auswahlkriterien der 11 Proben für die Immunhistochemie wurden nicht in die Studienbeschreibung aufgenommen). Darüber hinaus berichten sie über einen signifikanten Zusammenhang zwischen HOMA-IR und Makrophagengehalt bei diesen 11 Personen, den wir teilweise mit grenzwertiger Signifikanz (p-Wert von 0,054) für einen Vergleich von Insulinresistenten mit insulinsensitiven Personen bei allen 20 Studienteilnehmern bestätigen.