Filmgenerierung der 30o-Rotation der γ-Untereinheit bei Enzephalopathie F1-ATPase durch Freisetzung von Phosphat aus der γ-Untereinheit. Der Film beginnt mit einem Blick von der Seite von F1-ThioP in Farbbanddarstellung, mit dem gebundenen Thiophosphat als orangefarbene Kugeln. Die α- und β-Untereinheiten sind rot bzw. gelb. Dann werden die ATP-, aDP-, ßTP- und ßDP-Untereinheiten sequentiell entfernt, wobei das aEßE-Dimer und die zentralen Stieluntereinheiten γ, δ und ε (blau, magenta bzw. Dieser Restsubkomplex wird um 100 ° um die y-Achse nach rechts gedreht, um eine Seitenansicht der aE-Untereinheit und des zentralen Stiels freizulegen. Dann werden die δ- und ε-Untereinheiten und Reste γ-42-210 entfernt und die δ-Untereinheit wird schwächer. In den letzten Frames wird das gebundene Phosphat freigesetzt und die aE-Untereinheit öffnet sich und bewegt sich von der γ-Untereinheit weg, wodurch die Wechselwirkungen zwischen den aE- und γ-Untereinheiten unterbrochen werden. Um diese Wechselwirkungen wiederherzustellen, rotiert die γ-Untereinheit um 30°. Die Struktur des Endzustands ist der Postphosphatfreisetzungszustand der in F1-I3-ThioP gefundenen bovinen F1-ATPase.

Rotation angetrieben durch pmf

Das wichtigste fehlende Datum für das Verständnis der Erzeugung der Rotation aus dem pmf ist die detaillierte Struktur auf atomarer Ebene des Weges, den die Protonen durch die Membrandomäne des Enzyms nehmen. Die bisher beste verfügbare Struktur ist diejenige, die wir 2015 mit einer Auflösung von 4 Å durch Röntgenkristallographie des Enzymkomplexes von Paracoccus denitrificans bestimmt haben . Andere wurden 2015 und 2016 durch Kryoelektronenmikroskopie von Einzelpartikeln der Rinder- und Pilzenzyme bestimmt, bestenfalls bei 6 Å Auflösung . Diesen Modellen fehlt jedoch allesamt das Detail, das für die Formulierung eines molekularen Mechanismus der Erzeugung der Rotation aus der Protonenantriebskraft erforderlich ist, und aufgrund der Beweglichkeit und Flexibilität der Enzyme können einzelne Partikel des Enzyms viele verschiedene Positionen einnehmen. Daher stellt es ein ungewöhnlich schwieriges Problem für den Kryo-Em-Ansatz dar.

Abbildung Der Membrandomäne der F-ATPase aus P. angusta. In A-D ist die a-Untereinheit Kornblumenblau. A und B, Ansichten in durchgezogener Darstellung von der Seite und unterhalb der Membrandomäne. Der c10-Ring ist grau, die b-Untereinheit (oberer Teil nicht gezeigt) ist rosa, und die hellgelben, ziegelroten, hellcyanfarbenen und beigen Segmente sind Transmembran-α-Helices, Ch1-Ch4 der Untereinheit f zugeordnet, ATP8, aH1 und bH1, beziehungsweise. Im c-Ring zeigen I-IV die vier transmembranen C-terminalen α-Helices in Kontakt mit der Untereinheit a. C und D, Ansichten der a-Untereinheit in fester und rechteckiger Darstellung von außen betrachtet und von der Grenzfläche mit dem C-Ring mit aH1 in blassem Cyan. Konservierte polare Reste sind gelb, die Positionen menschlicher Mutationen, die mit Pathologien assoziiert sind (siehe Tabelle S1), sind rot. Die rosa Kugel kennzeichnet das konservierte Arg-179 in aH5, das für die Protonentranlokation essentiell ist. Der untere Pfeil zeigt den Eintrittspfad für Protonen an, die in der C-terminalen α-Helix-II des C-Rings zu Glu-59 transferieren. Sie werden von oben gesehen gegen den Uhrzeigersinn um den Ring herum getragen, bis sie bei Arg-179 ankommen, wo sie in den mit dem oberen Pfeil bezeichneten Austrittspfad eintreten.

Strukturen bakterieller ATP-Synthasen

Abbildung bakterieller ATP-Synthasen. (A) F1-ATPase aus Caldalkalibacillus thermarum bei 2,6 Å Auflösung durch Röntgenkristallographie; (B) ATP-Synthase-Enzym aus Paracoccus denitrificans bei 4 Å Auflösung durch Röntgenkristallographie; (C) ATP-Synthase aus Escherichia coli bei 7 Å Auflösung durch Kryo-EM.Im Vergleich zu den umfangreichen Studien, die wir an mitochondrialen Enzymen durchgeführt haben, wurden die Strukturen der bakteriellen ATP-Synthasen wenig untersucht, mit Ausnahme der Strukturen der F1-katalytischen Domänen der Enzyme aus Escherichia coli und Lactobacillus stearothermophilus (ehemals Bacillus stearothermophilus) bei 3,2 bzw. 3,9 Å Auflösung und Strukturen der c-Ringe aus ihren Membrandomänen aus verschiedenen Spezies . Um diese Lücke zu füllen, haben wir bisher die Struktur des gesamten Enzyms aus Paracoccus denitrificans in 4 Å Auflösung und in Zusammenarbeit mit Professor G. M. Cook und Kollegen in Dunedin, Neuseeland, die Strukturen der F1-katalytischen Domänen der ATP-Synthasen aus Caldalkalibacillus thermarum, Fusobacterium nucleatum und Mycobacterium smegmatis beigesteuert. C. thermarum ist ein Thermoalkali-phil, und die Struktur seiner katalytischen Domäne mit einer Auflösung von 2,6 Å ist die genaueste Struktur einer bakteriellen F1-ATPase, die bisher bestimmt wurde . Das Enzym von M. smegmatis ist eng mit dem Enzym aus M. tuberculosis verwandt. Die Struktur seiner katalytischen Domäne wurde mit einer Auflösung von 4 Å bestimmt und bietet ein Ziel für die Entwicklung neuer antituberkulärer Medikamente . Der opportunistische Parodontalpathogen Fusobacterium nucleatum ist mit einer Vielzahl von Krankheiten assoziiert, darunter orale Infektionen, frühe Schwangerschaftsergebnisse, Magen-Darm-Erkrankungen und Atherosklerose. Es wurde auch mit der Entwicklung und dem Fortschreiten von Darmkrebs durch Hemmung der Antitumor-Immun-Signalwege und anschließende Förderung der Chemoresistenz in Verbindung gebracht. Es ist ein obligates Anaerob und koppelt die freie Energie der Decarboxylierung von Glutaconyl-CoA an Crotonyl-CoA an den Transport von Na + -Ionen über seine Zellmembran, um eine Natriumionen-Antriebskraft (smf) zu erzeugen. Die ATP-Synthase nutzt die smf, um die Synthese von ATP für katabole und anabole Reaktionen erforderlich zu fahren. Die Struktur seiner F1-katalytischen Domäne wurde mit einer Auflösung von 3,6 Å bestimmt. Unter Verwendung von Cryo-EM wurde eine Karte der intakten ATP-Synthase von E. coli veröffentlicht, die die ε-Untereinheit in der „up“ -Position zeigt (siehe unten) , und kürzlich wurde eine Struktur der ATP-Synthase von Geobacillus stearothermophilus zu 3 Å bestimmt .

Struktur der Parasiten-ATP-Synthasen

Abbildung Die F1-ATPase aus Trypanosoma brucei. Die α-, β-, γ-, δ-, ε- und p18-Untereinheiten sind rot, gelb, Blau, Grün, Magenta und Cyan. (A und B) Zeichentrickdarstellungen der Seiten- und Draufsichten; (C-E) Oberflächendarstellungen von (C) der bovinen F1-ATPase, (D) der T. brucei-Enzym in grau mit entferntem p18 und die farbigen Abschnitte, die die Aminosäuren zusätzlich zum Rinderenzym zeigen, und (E) das T. brucei-Enzym mit vorhandenem p18.

Die Strukturen und Funktionen der Komponenten von ATP-Synthasen, insbesondere derjenigen Untereinheiten, die direkt an der katalytischen Bildung von ATP beteiligt sind, sind in Metazoen, Pilzen, Eubakterien und pflanzlichen Chloroplasten weit verbreitet. Anhand einer Karte am 32.5 Å Auflösung in situ bestimmt in den Mitochondrien des Euglenozoenparasiten Trypanosoma brucei Durch Elektronenkryotomographie wurde vorgeschlagen, dass die ATP-Synthase in dieser Spezies eine nicht-kanonische Struktur mit verschiedenen katalytischen Stellen aufweist, wobei der katalytisch essentielle Argininfinger nicht wie bei allen bisher untersuchten Spezies von der α-Untereinheit neben der katalytischen Nukleotidbindungsstelle bereitgestellt wird, sondern von einem Protein namens p18, das nur in den Euglenozoen vorkommt . In Zusammenarbeit mit Dr. Alena Zíková und Ondřej Gahura vom Institut für Parasitologie in České Budějovice in der Tschechischen Republik haben wir die F1-ATPase aus T. brucei charakterisiert und eine Kristallstruktur des Enzyms mit einer Auflösung von 3,2 Å bestimmt. Diese Struktur zeigt, dass der Vorschlag, dass die katalytische Domäne dieser ATP-Synthase eine nicht-kanonische Struktur und verschiedene katalytische Stellen aufweist, falsch ist. In vielerlei Hinsicht ist die Struktur der T. brucei F1-ATPase der zuvor bestimmten F1-ATPase sehr ähnlich. Der α3β3-sphärische Teil der katalytischen Domäne, in dem sich die drei katalytischen Stellen sowie der zentrale Stiel befinden, ist hochkonserviert, und der Argininfinger wird herkömmlicherweise durch die α-Untereinheiten bereitgestellt, die an jede der drei katalytischen Stellen angrenzen in den β-Untereinheiten gefunden. Somit hat das Enzym einen herkömmlichen katalytischen Mechanismus. Die Struktur unterscheidet sich von früheren durch eine p18-Untereinheit, die nur in den Euglenozoen identifiziert wird und mit der äußeren Oberfläche jeder der drei α-Untereinheiten assoziiert ist, wodurch die F1-Domäne ausgearbeitet wird. Untereinheit p18 ist ein Pentatricopeptid Repeat (PPR) Protein mit drei PPRs und scheint keine Funktion im katalytischen Mechanismus des Enzyms zu haben. T. brucei ist der Erreger der Schlafkrankheit beim Menschen und verwandter Krankheiten bei Haustieren, die in Afrika südlich der Sahara leben, und die Struktur seiner F1-ATPasen bietet ein Ziel für die Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung der Krankheit.

Die Rolle von Cardiolipin

Das anionische Lipid Cardiolipin ist ein wesentlicher Bestandteil aktiver ATP-Synthasen. In Metazoen enthalten ihre Rotoren einen Ring aus acht c-Untereinheiten, die aus inneren und äußeren Kreisen von N- bzw. Der Anfang der C-terminalen α-Helix enthält einen streng konservierten und vollständig trimethylierten Lysinrest im Lipidkopfgruppenbereich der Membran. Größere Ringe bekannter Struktur, von c9-c15 in Eubakterien und Chloroplasten, konservieren entweder einen Lysin- oder einen Argininrest in der äquivalenten Position. In Computersimulationen von hydratisierten Membranen, die trimethylierte oder unmethylierte bovine c8-Ringe und bakterielle c10- oder c11-Ringe enthielten, wurden die Kopfgruppen von Cardiolipinmolekülen selektiv mit diesen modifizierten und unmodifizierten Lysinresten und mit benachbarten polaren Aminosäuren und mit einem zweiten konservierten Lysin auf der gegenüberliegenden Seite der Membran assoziiert, während Phosphatidyllipide wenig von diesen Stellen angezogen wurden .

Abbildung Modi der Bindung von Cardiolipin an trimethylierte c8-Ringe. Die N- und C-terminalen α-Helices von c-Untereinheiten sind dunkel bzw. hellgrau. Cardiolipinmoleküle sind grün mit rosa Phosphatgruppen. Große farbige Kugeln stellen die groben Kornkügelchen für spezifische Aminosäuren dar, wie angegeben, die innerhalb von 0,7 nm der Phosphatkügelchen von Cardiolipin liegen. Teile A und B, die Kopfgruppenregion von Cardiolipin in der inneren Packungsbeilage der Membran, die jeweils an zwei benachbarte c-Untereinheiten (Untereinheiten 8 und 1) und an eine einzelne c-Untereinheit gebunden ist; Teil C, ein Cardiolipinmolekül in der äußeren Packungsbeilage der Membran, das an eine einzelne c-Untereinheit gebunden ist.

Die Verweilzeiten der Cardiolipinmoleküle mit dem Ring waren jedoch kurz und ausreichend, um den Rotor nur um einen Bruchteil eines Grades im aktiven Enzym zu drehen. Mit dem demethylierten c8-Ring und mit c10- und c11-Ringen nahm die Dichte der gebundenen Cardiolipinmoleküle an dieser Stelle zu, die Verweilzeiten wurden jedoch nicht stark verändert. Diese hochspezifischen, aber kurzen Wechselwirkungen mit dem rotierenden C-Ring stimmen mit der funktionellen Rolle von Cardiolipin bei der Stabilisierung und Schmierung des Rotors überein, und, durch Wechselwirkung mit dem Enzym am Einlass und Ausgang des Transmembranprotonenkanals, in der Teilnahme an der Protonentranlokation durch die Membrandomäne des Enzyms.