na de introductie van een bijzonder neuro-invasieve en virulente stam van West Nile virus (WNV) in het noordoosten van de Verenigde Staten, was er een dramatische uitbraak van fatale infecties bij vogels, vergezeld van veel kleinere maar alarmerende aantallen fatale infecties bij paarden en mensen.1,16,17,20,22 binnen 3 jaar had het nieuw geïntroduceerde Flavi-virus het Noord-Amerikaanse continent doorkruist, waardoor duizenden dode vogels en duizenden bevestigde ziektegevallen achterbleven, waaronder honderden doden bij paarden en mensen. Er is minder melding gemaakt van morbiditeit en mortaliteit bij andere huisdieren. Vogel-en paardengevallen piekten in Mississippi in 2002.

begin November 2002 werd een 2-jarige, gesteriliseerde Maltese Terriër aan de verwijzende dierenarts aangeboden met een acuut begin van episodisch, ongecontroleerd rollen, dat zich snel ontwikkelde tot tremoren over het hele lichaam en ataxie. De initiële behandeling met oraal fenobarbital en een korte prednison kuur gaven een minimale verbetering. Na 1 week werd de zaak doorverwezen naar het Animal Health Center, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University, MS. Het neurologisch onderzoek toonde tekenen aan van chorea bestaande uit onvrijwillige, onregelmatige, schokkerige onvoorziene bewegingen waarbij het hele lichaam betrokken was. De oogbollen vertoonden ook soortgelijke onregelmatige bewegingen. Bewuste proprioceptie en hoppende reacties waren ook licht afgenomen in de voorste ledematen. Ziekten die onvrijwillige onvoorziene bewegingen veroorzaken hebben meestal invloed op gebieden van de hersenschors, of specifieke extrapiramidale kernen van de telencephalon, of craniale hersenstam.10 de differentiële diagnose omvatte multifocale ontstekingsziekten-infectieus, niet-infectieus en immuungemedieerd. Complete bloedtelling en serumchemie waren onopvallend en analyse van cerebrospinale vloeistof (CSF) toonde geen significante afwijkingen aan. Een elektro-encefalogram toonde veranderingen die wijzen op encefalitis. Op basis van klinische symptomen en elektro-encefalogram resultaten, de hond werd behandeld voor infectieuze oorzaken van encefalitis. Tijdens de ziekenhuisopname op de intensive care werd de hond zeer prikkelbaar. Behandeling met doxycycline, clindamycine, diazepam, difenhydramine en vloeistoffen kon de toenemende ernst van onwillekeurige bewegingen en intermitterende perioden van hyperthermie niet voorkomen (tot 108 F/42,2 C).

serologie voor Toxoplasma gondii, Neospora caninum (ProtaTek, Chandler, AZ), Ehrlichia canis en Rickettsia rickettsii (Antech, Southaven, MO) waren negatief en gepaarde serum-en CSF-titers voor canine distempervirus en parvovirus (Colorado Veterinary Diagnostic Laboratory, Ft. Collins, CO) wees op beschermende immuniteit, maar liet geen intrathecale antilichaamproductie zien. Na 6 dagen van ziekenhuisopname en behandeling, ongeveer 2 weken na het begin van de klinische symptomen, de hond werd geëuthanaseerd vanwege de verslechterende toestand.

Necropsieonderzoek toonde geen grove afwijkingen aan. Microscopisch onderzoek van de hersenen toonde een milde, multifocale, niet-suppuratieve meningoencephalitis, die grijze materie of gemengde grijs/witte materie gebieden zoals de hersenstam betrokken. Dit werd gekenmerkt door kleine perivasculaire manchetten van lymfocyten binnen het parenchym en soms de aangrenzende leptomeninges. Milde microgliose van de neuropil ging vaak gepaard met de perivasculaire cuffing (Fig. 1). Foci van ontsteking, die soms bilateraal waren, waren aanwezig in de pyriform kwab en bijbehorende parahippocampale gyrus en hippocampus, de pons en medulla, en de cerebellaire cortex. Een unieke laesie dicht bij de middellijn raphe van het medulla op het niveau van de olivaire kernen bestond uit een gebied van necrose met fibrine-effusie en bloeding, clusters van macrofagen (gittercellen), en vele gezwollen axonen (sferoïden) met een paar kleine lymfocytaire manchetten in de buurt (Fig. 2). Sferoïden positief gekleurd door de bielschowsky ‘ s methode voor axonen.De enige andere significante bevindingen waren beperkt tot de lever, die een fragmentarische individualisering van hepatocyten, cytoplasmatische eosinofilie, nucleaire pyknose en lysis van hepatocyten (acute diffuse matige levernecrose) vertoonden, met talrijke binucleaire hepatocyten en zonder significante inflammatoire celinfiltratie. Talrijke ontluikende gist met pseudohyphae (Candida sp.) aanwezig waren in het maagslijm zonder bewijs van slijmvliesinvasie of ontsteking.

Fig. 1. Cerebrum, hond. Verspreide kleine perivasculaire manchetten van mononucleaire ontstekingscellen en milde microgliose in de pyriformkwab. Hij vlek. Bar = 35 µm.

Fig. 2. Medulla oblongata; hond. Een gebied aan de middellijn raphe van het medulla met veel gezwollen axonen (sferoïden) aangegeven met pijlen, rondom een gebied van necrose met bloedingen en macrofagen. Hij vlek. Bar = 70 µm.

polymerasekettingreactie (PCR) voor WNV werd uitgevoerd op gefixeerde hersenen en niet-gefixeerde ruggenmerg, lever en nieren. Stukjes met formaline gefixeerde hersenen met een gewicht van 30-100 mg werden verwijderd uit de medulla oblongata in de buurt van de lesioned site en diverse andere sites in de hersenstam, cerebrale cortex en cerebellum, gespoeld met water, en geplaatst in RNAlater™ reagens (QIAgen, Valencia, CA) gedurende ten minste 1 uur voor RNA-extractie. Monsters van bevroren niet-gefixeerde ruggenmerg, nieren en lever werden geëxtraheerd zonder voorbewerking. Weefsel monsters werden verstoord met behulp van een motor-aangedreven stamper (Pelletpestel, Kontes, Vineland, NJ), en RNA werd geëxtraheerd met behulp van Trizol™ reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) of RNea-sy™ mini spin kolommen (QIAgen), volgens de instructies van de fabrikant. Reverse transcriptase-geneste-polymerasekettingreactie (rtnPCR) werd uitgevoerd met behulp van de geneste primers en een wijziging van de methode beschreven door Johnson et al., 12 met commerciële reagenskits (OneStep ™ RT PCR, Qiagen, Valencia, CA, en Taq SuperPak™, Sigma, St. Louis, MO). Positieve controle was een 1 : 1000 verdunning van gepoold RNA geëxtraheerd uit niet-gefixeerde WNV-positieve aviaire weefsels (voornamelijk nieren en hersenen). De banden van DNA werden ontdekt na agarosegelelektroforese gebruikend GelStar (Cambrex, East Rutherford, NJ). Drie van vijf stukken van formaline-gefixeerde medulla waren positief op rtnPCR, terwijl alle andere specimens van vaste hersenen (cerebrale cortex, cerebellum, en hersenstam) en niet-gefixeerde (bevroren) ruggenmerg, nier, en lever negatief waren.

immunohistochemie (IHC) werd uitgevoerd in een poging om WNV-antigeen aan te tonen. Secties van formaline-gefixeerde, paraffine-ingebed (FFPE) weefsels werden gesneden op 5 µm en gekleurd met behulp van een autosainer (Dako, Carpinteria, CA) en voorverpakte streptavidine–biotine–mierikswortel peroxidase detectie reagentia (Lsab2, Dako), volgens de instructies van de fabrikant. Secties van hersenen, nier, alvleesklier, lever, hart, milt, bijnier, en tong werden bevlekt gebruikend muriene polyclonal antilichaam voor WNV (VR-1267-AF, ATCC, Manassas, VA) na voorbehandeling met proteinase K (Dako). Dit polyclonal antilichaam toonde matige diffuse achtergrondkleuring in alle weefsels, complicerende interpretatie. Er werd geen specifieke kleuring gezien behalve mogelijk in de hersenen waar de neuronen diffuus uniform licht cytoplasmisch kleuring toonden vergeleken met controledia gekleurd met irrelevante monoclonal IgG1. De resultaten werden beschouwd als dubbelzinnig vanwege de hoge achtergrondkleuring en diffuse aard van neuronale kleuring, met weinig variatie in intensiteit. Deze resultaten suggereerden een tekort aan antigeen in de hersenen van de hond, in vergelijking met geïnfecteerde aviaire weefsels waar robuuste cytoplasmatische kleuring werd gezien.

Hersensecties werden ook gekleurd met monoklonaal antilichaam tegen canine distemper virus nucleoproteïne (CDV-NP, VMRD, Pullman, WA), met negatieve resultaten. IHC op FFPE brain voor rabiësvirus werd uitgevoerd in een ander laboratorium (Prairie Diagnostic Service, Saskatoon, SK, Canada), met negatieve resultaten.

hoewel fatale encefalitis als gevolg van WNV goed gedocumenteerd is bij veel vogelsoorten,22 paarden,8 en mensen,zijn 20 klinische symptomen van de ziekte veroorzaakt door dit virus zelden gedocumenteerd bij honden. In gebieden waar WNV endemisch is, geeft een hoge prevalentie van specifiek neutraliserend antilichaam aan dat infectie bij honden vaak voorkomt, zelfs als klinische ziekte dat niet is. Eén serosurvey uit Zuid-Afrika, waar WNV endemisch is, toonde aan dat 37% van de honden neutraliserende antilichamen tegen WNV had.5 een serosurvey in New York City, onmiddellijk na de eerste identificatie van WNV op het westelijk halfrond, toonde aan dat een hoger percentage honden (10%) dan paarden (3%) of mensen (2,5%) specifiek neutraliserend antilichaam had in de buurt van het epicentrum van de uitbraak (koninginnen).15 een eerder rapport uit Zuid-Afrika beschreef de isolatie van een virus, later geïdentificeerd als WNV, uit de hersenen van een hond met ernstige klinische tekenen van encefalitis.7,21 in één experiment veroorzaakte infectie van drie honden met WNV asymptomatische seroconversie bij alle drie maar meetbare viremie bij slechts één van deze dieren, die later bleek te lijden aan hyperadrenocorticisme.Een meer recente studie waarbij de Amerikaanse stam werd gebruikt, toonde lage viremie aan bij alle vier de honden en acht geïnfecteerde katten,2 zonder klinische symptomen bij honden en slechts lichte, voorbijgaande koortsziekte bij katten.

twee recente meldingen van ernstige WNV-infectie bij Amerikaanse honden zijn gepubliceerd. Buckweitz et al. beschreven postmortem bewijs van WNV replicatie in vele weefsels van een 11-jarige, mannelijke, gemengde ras hond met nier-en centraal zenuwstelsel (CNS) ziekte; kwantitatieve reverse transcriptase-polymerase kettingreactie (RT–PCR) vond dat virale sequenties waren het meest aanwezig in de nieren, gevolgd door hart, hersenen, long, en milt.6 Lichtensteiger et al. beschrijf postmortem bevindingen na euthanatisatie van een 8-jarige, gemengd ras hond met ernstige somatische ziekte die myocarditis opgenomen, evenals fatale WNV encefalitis in een 3 maanden oude wolf pup.In beide rapporten werden antigeen-en gensequenties van WNV gedocumenteerd, waarbij respectievelijk IHC en RT-PCR werden gebruikt in meerdere extraneurale weefsels geassocieerd met laesies van necrose en ontsteking.

dit rapport documenteert een geval van ernstige neurologische ziekte bij een jonge volwassen hond met een duur van 2 weken van CZS-symptomen, waarbij bewijs van WNV-infectie beperkt was tot de hersenen. Histologische laesies in de hersenen waren niet-specifiek,maar verenigbaar met bevindingen van WNV-encefalitis gemeld bij paarden,8 mensen,20 en de twee meldingen bij honden,6, 18 zowel met betrekking tot locatie (hersenstam en medulla) en type (niet-suppuratieve encefalitis met gebieden van necrose). De klinische tekenen van (het rollen) saldoverlies en ataxie zouden met cerebellomedullaire ziekte verenigbaar zijn, terwijl de gehele lichaamtremoren een meer diffuse verstoring van de hersenen suggereren. Bewijs van meningoencephalitis werd gevonden in de pyriform kwab en hippocampus, hersenstam, en cerebellum/medulla, maar spaarde veel van de prosencephalon. Levernecrose zonder bewijs van lokale virale replicatie (PCR-en IHC-negatief) was in dit geval mogelijk het gevolg van de ernstige recidiverende hyperthermie. Leverschade als gevolg van eerdere virusreplicatie die tijdens de ziekte werd geklaard, kan niet worden uitgesloten hoewel er geen ontsteking zichtbaar was. Talrijke binucleaire hepatocyten suggereerden subacute schade bij regeneratie. De aanwezigheid van Candida-gist in de maag werd beschouwd als een incidentele bevinding toe te schrijven aan behandeling met antibiotica. In tegenstelling tot de bevindingen van Buckweitz et al.6 en Lichtensteiger et al., 18 geen laesies, virale nucleïnezuren, of virale antigeen werden gedetecteerd in extraneurale weefsels met inbegrip van bevroren en vaste nier en lever van deze hond.

het gebied van necrose in de hersenstam van deze hond werd geassocieerd met een gelokaliseerde macrofaagrespons (gittercellen), maar niet met een openlijk lokaal inflammatoir infiltraat dat,zoals beschreven bij paarden, suggereert 8 dat de laesie een vasculaire of mogelijk immuungemedieerde etiologie kan hebben in plaats van een directe cytolytische of inflammatoire etiologie. IHC voor WNV op de hersenen was niet in staat om overtuigend viraal antigeen aan te tonen in dit geval en in het geval gerapporteerd door Buckweitz et al., 6 wijst op lagere niveaus van virusreplicatie dan waargenomen in aviaire weefsels, opnieuw vergelijkbaar met de bevindingen bij paarden.12 Lichtensteiger et al.18 meldde geen IHC van de hersenen.

het relatief hogere percentage neurologische ziekten dat wordt gezien bij paardeninfecties met de Amerikaanse WNV-stam in vergelijking met die in Italië8 wordt ondersteund door experimentele studies bij muizen, die erop wijzen dat de Amerikaanse stam zeer neuro-invasief is in vergelijking met andere stammen.3 aanvullende studies bij muizen hebben aangetoond dat blootstelling aan gasvormige anesthetica en CO2 WNV neuro-Invasion verhogen op een concentratie-en tijdsafhankelijke manier,4,13 suggereert dat andere milieu-of gastheerfactoren de ontwikkeling van neurologische ziekte bij dieren kunnen beïnvloeden. De lage incidentie van klinische ziekte gezien bij honden in het gezicht van hoge seroprevalentie suggereert dat honden meer resistent zijn tegen neuro-Invasion dan mensen of paarden.

bewijs van extraneurale infectie werd niet gevonden bij paarden met WNV-encefalomyelitis8 zoals bij deze hond. Misschien had bij deze Maltese Terriër de immuunrespons het virus verwijderd uit extraneurale weefsels. De aanwezigheid van overvloedige virale replicatie in extraneurale weefsels in de twee andere rapporten van US canine infecties suggereert dat sommige virale replicatie optreedt in extraneurale weefsels vóór neuro-Invasion en dat de nier en het hart zijn waarschijnlijk doelweefsels in de hond. Buckweitz et al.6 suggereren nierbiopsie voor de diagnose van WNV-infectie bij honden, maar Lichtensteiger et al.18 Er werd geen viraal antigeen gevonden in de nier van de onderzochte hond. De klinische waarde van renale biopsy18 of zelfs urinetests voor WNV, vermoedelijk met RT-PCR, is nog niet kritisch geëvalueerd.

Extraneurale replicatie van WNV bij mensen kan worden geëxtrapoleerd uit meldingen van fatale encefalitis bij ontvangers van nieren van geïnfecteerde donoren die 13-18 dagen na transplantatie begonnen en van ernstige encefalitis bij een hartontvanger,9,11, wat aangeeft dat de ziekte kan worden overgedragen via bloed-of orgaantransplantatie. Verder bewijs van robuuste WNV-replicatie in extraneurale weefsels van zoogdieren wordt gepresenteerd in een recent rapport waarin fatale WNV-infectie bij drie oostelijke Vosseneekhoorns wordt gedocumenteerd, met bewijs van renale, cerebrale, cardiale, hepatische en pulmonale virale replicatie.14 aanvullende studies zijn nodig om de details van de biologie en pathofysiologie van WNV infecties bij zoogdieren te verduidelijken.

het blijvende belang van WNV voor de gezondheid van mens en dier in dit land zal er waarschijnlijk toe leiden dat het virus endemisch wordt met sporadische uitbraken. Volksgezondheidsinstanties verstrekken vaak tijdig informatie over uitbraken van ziekten bij de mens. Het is mogelijk dat analyse van antilichamen tegen WNV in honden-en kattensera waardevolle epidemiologische informatie kan opleveren over de verspreiding en incidentie van WNV.