DESCRIPTION AND GENERAL NOTES

Restriction endonucleases (REs) zijn bacteriële enzymen die dubbelstrengs DNA splitsen. Type I REs is belangrijk in bacteriële functie maar splijt DNA niet bij specifieke opeenvolgingen. Type II REs, beschreven voor gebruik in dit handboek, vereist zeer specifieke plaatsen voor DNA-splitsing en zijn dus uiterst nuttige hulpmiddelen in moleculaire biologie. Deze enzymen staan het klonen en de zuivering van bepaalde fragmenten van DNA toe. De 500 of zo bekende REs zijn meestal geïsoleerd uit een verscheidenheid van bacteriestammen.

REs zijn aanwezig in bacteriën die vermoedelijk DNA uit vreemde bronnen vernietigen (bv. bacteriofaag infecteren) door het vreemde DNA op specifieke herkenningsplaatsen te splitsen. Het DNA van de gastheerbacteriën wordt beschermd tegen splitsing omdat de specifieke herkenningsplaatsen worden gewijzigd, meestal door methylering op een van de basen in de plaats, waardoor de plaats niet langer een substraat voor splitsing is. Praktisch, zijn REs met verschillende specificiteiten van de herkenningsplaats gezuiverd van diverse bacteriestammen en door moleculaire biologen onder bepaalde voorwaarden gebruikt om gezuiverd DNA van eukaryotic bronnen in bepaalde fragmenten in een in vitro reactie te splitsen. De gastheerbacteriën die worden gebruikt om gekloond DNA in het laboratorium te verspreiden zijn gewoonlijk mutant in de genen van de gastheerbeperking (hsdR, hsdM, of HSD ‘ s); aldus zullen hun intracellular enzym activiteiten niet de buitenlandse recombinante opeenvolgingen vernietigen.

Deze uiteinden zijn complementair (“sticky”) en kan worden enzymatisch doorgegaan naar een andere EcoRI-gegenereerde termini met T4-DNA-ligase. Andere REs herkennen verschillende sequenties en maken unieke splitsingen die resulteren in andere gedefinieerde eindpunten, waarvan sommige ook 5′ uitstekende uiteinden, 3′ uitstekende uiteinden, of geen uitstekende (stompe) uiteinden (zie tabel 5.1). Elk RE heeft een specifieke opeenvolging en aantal nucleotiden vereist om de erkenningsplaats tot stand te brengen. Sommige REs vereisen geen specifiek nucleotide in elke positie van de erkenningsplaats. Bijvoorbeeld, in sommige gevallen is een purinenucleotide (A of G) in een bepaalde positie voldoende. De frequentie waarmee een RE DNA zal snijden is dus gerelateerd aan het aantal basen in de herkenningssequenties (als er meer basen nodig zijn, zijn minder bezuinigingen geschikt om te worden gemaakt) en de specifieke basen in elke positie.

REs zijn nuttig omdat hun specificiteit en de resulterende ligeerbare eindpunten de ontleding, analyse en herstructurering van DNA op een gecontroleerde, voorspelbare, locatiespecifieke manier mogelijk maken. Omdat ze enzymen zijn, heeft elk specifieke eisen voor voorwaarden die leiden tot een optimale splitsing activiteit. Gelukkig zijn velen actief onder vergelijkbare omstandigheden, met de primaire variabele is Ionische sterkte (dat wil zeggen, NaCl in de buffer). Praktische voorwaarden zijn empirisch gedefinieerd voor het gebruik van elke He als onderzoeksinstrument.

de hoeveelheid RE-activiteit wordt gewoonlijk niet gedefinieerd met behulp van klassieke enzymkinetiek. In plaats daarvan wordt he-activiteit in praktische termen gedefinieerd voor gebruik in het laboratorium. Een eenheid (U) van activiteit voor een RE wordt gewoonlijk gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die 1 µg op alle specifieke plaatsen in een DNA-monster (gewoonlijk bacteriofaag λ) in 1 uur bij 37°C snijdt. De werkelijke activiteit kan anders zijn als er extra verteringsplaatsen aanwezig zijn. Bijvoorbeeld, als 1 U van een RE voldoende is om 1 µg bacteriofaag λ DNA volledig op één plaats onder standaard assayvoorwaarden te snijden, kan het niet in staat zijn om 1 µg van een DNA-monster dat vier plaatsen voor een RE heeft, of een monster dat niet voldoende gezuiverd is volledig te snijden.

andere factoren met betrekking tot de reactieomstandigheden beïnvloeden ook de RE-activiteit. Deze omvatten zuiverheid van DNA, buffer, temperatuurvoorwaarden, en RE zelf. Methylering van DNA, gebonden eiwit, of overmatige viscositeit van DNA met een hoog molecuulgewicht in viskeuze oplossingen kan de efficiëntie van een RE digest verminderen. Het DNA dat moet worden gesneden moet meestal vrij zijn van onzuiverheden; SS-fenol / chloroform extractie en ethanol precipitatie (sectie 20-1) zal veel storende onzuiverheden verwijderen. In tegenstelling, worden de meeste REs gewoonlijk niet nadelig beà nvloed door RNA of single-stranded DNA. Zo kan de toevoeging van tRNA als coprecipitant nuttig zijn bij het terugwinnen van kleine hoeveelheden DNA zonder latere RE-verteringen te beïnvloeden.

de typische testvoorwaarde voor een RE-reactie bevat een buffer (10 mM Tris, pH 7,4 is gebruikelijk), 10 mM Mg2+, en is vrij van aanzienlijke concentraties chelaatvormers (de buffer bevat een voldoende lage hoeveelheid EDTA). De RE-buffers bevatten ook de juiste zoutconcentraties om de optimale Ionische sterkte voor elke RE te geven. In sommige gevallen worden BSA, DTT en spermidine toegevoegd om optimale enzymactiviteit te bieden. Vier veralgemeende RE-buffers kunnen voldoen aan de eisen voor de meeste REs, en de voorafgaande bereiding van 10 × voorraden van deze buffers wordt hieronder beschreven. De meeste RE-vertests worden uitgevoerd bij 37°C, hoewel er een paar uitzonderingen, zoals TaqI.

De meeste gekochte REs worden geleverd met een geschikte opslagbuffer, maar deze bevat 25-50% glycerol om bevriezing tijdens opslag bij -20°C Te voorkomen. concentraties glycerol van meer dan 5% (vol / vol) in verteringstests kunnen de activiteit van veel REs remmen.bovendien kunnen hoge glycerolconcentraties tijdens verteringstests de sequentiespecificiteit van sommige REs verminderen, wat resulteert in onechte splitsingen. Dit verschijnsel wordt bijvoorbeeld gezien met de veelgebruikte RE EcoRI, waarbij de onechte activiteit die onder bepaalde omstandigheden wordt waargenomen, EcoRI * (ster) activiteit wordt genoemd. Om deze redenen is het belangrijk het volume van de re-verterings reactie groot genoeg te maken om ten minste een 1:10 verdunning van de RE zelf te omvatten (en zo de glycerolconcentratie te verlagen). Andere factoren, zoals pH, ethanol, of onjuiste zoutconcentratie kan ook steractiviteit of verminderde activiteit veroorzaken; dus, zorgvuldige naleving van aanbevolen voorwaarden is belangrijk.

een paar andere overwegingen zijn nuttig bij het gebruik van REs. gebruik een nieuwe pipettip telkens wanneer een RE wordt overgedragen. Sporen van contaminanten die aan het RE-bestand worden toegevoegd, kunnen het verdere gebruik ervan verhinderen en de resultaten die bij volgende experimenten worden verkregen, in verwarring brengen. Bij het optimaliseren van reacties is het beter om extra RE toe te voegen dan om veel langer dan 1 uur te incuberen. verder is, zoals hierboven vermeld, enzymactiviteit alleen gedefinieerd voor het snijden van een DNA-standaard. Omdat uw monster over het algemeen heel anders is dan de standaard, is een goede gids om ongeveer 2-3 u RE per microgram DNA te gebruiken om te worden gesneden, vooral wanneer het proberen om een moeilijk monster te verteren. Het kan soms nodig zijn om de hoeveelheid RE te titreren die nodig is om een DNA-monster naar behoren te verteren.

ten slotte moet bij het gebruik van twee REs aandacht worden besteed aan de optimale zoutomstandigheden van elk REs. Als beide dezelfde buffer vereisen, kan de spijsvertering gelijktijdig of opeenvolgend worden gedaan. Indien verschillende zoutomstandigheden vereist zijn, moet eerst de RE worden gebruikt die minder zout vereist. Na incubatie aanpassen van de zoutconditie, en verteren met de RE die hoog zout. RE-activiteit kan in alle gevallen worden verwijderd door SS-fenol/chloroform extractie. Sommige REs zijn thermolabiel en kunnen worden geïnactiveerd door te verhitten tot 70°C gedurende 5 min. Deze eigenschap verschilt echter van de ene RE tot de andere en moet worden geverifieerd voor elke gebruikte RE.