rotatie aangedreven door ATP-hydrolyse

de hydrolytische rotatiecyclus bestaat uit drie stappen van 120 ° in het katalytische F1-domein van het enzym, gedefinieerd in biofysische rotatie-experimenten met “katalytische zwermen” . Elke stap van 120o wordt verdeeld in substappen die door een katalytische verblijf na elke stap van 120o worden bepaald, met een tussenliggende “ATP-band” verblijf bij 30o en een “fosfaatversie” verblijf bij 95o. De versie van fosfaat staat het enzym toe om de stap 120o te voltooien en bij de ATP-band te komen wonen. Wij hebben de structuren van het F1-katalytische domein bij de fosfaatversie en katalytische dwells beschreven, en hebben aangetoond dat de 35O roterende sub-stap tussen fosfaatversie en katalytische dwells afhangt van de versie van fosfaat van de “ATP-binding” dwell, die dan het enzym toestaat om door te gaan naar de “katalytische dwell” . De katalytische woon zelf vertegenwoordigt een overgang waar een gebonden ATP molecuul voor hydrolyse wordt klaargemaakt. Onze huidige inspanningen zijn gericht op het definiëren van de katalytische verblijf in de encefalopathie F1-ATPase.

Film Generatie van 30o rotatie van de γ-subunit in encefalopathie F1-ATPase door het vrijkomen van fosfaat uit de ßE-subunit. De film begint met een blik vanaf de zijkant van F1-ThioP in lintweergave, met het gebonden thiofosfaat als Oranje bolletjes. De α-En β-subeenheden zijn respectievelijk rood en geel. Vervolgens worden de ATP-, aDP-, ßTP – en ßDP-subeenheden achtereenvolgens verwijderd, waardoor de aeße-dimeer en de centrale steel subeenheden γ, δ En ε (respectievelijk blauw, magenta en groen) achterblijven. Dit resterende subcomplex wordt 100° naar rechts om de y-as gedraaid om een zijaanzicht van de ae-subeenheid en de centrale stengel bloot te leggen. Vervolgens worden De δ – En ε-subeenheden en de residuen γ-42-210 verwijderd en wordt de overheveling-subeenheid zwakker. In de laatste frames komt het gebonden fosfaat vrij en de ae-subeenheid opent en beweegt zich weg van de γ-subeenheid, die verpakkingsinteractie tussen de AE – en γ-subeenheden verstoort. Om deze interacties te herstellen, roteert de γ-subeenheid met 30°. De structuur van de uiteindelijke toestand is de post-fosfaatafgiftetoestand van boviene F1-ATPase die wordt aangetroffen in F1-I3-ThioP.

rotatie aangedreven door pmf

het belangrijkste ontbrekende gegeven voor het begrijpen van het genereren van rotatie vanuit de PMF is de gedetailleerde structuur op atomair niveau van de route die de protonen door het membraandomein van het enzym nemen. De beste beschikbare structuur tot nu toe is die welke we in 2015 hebben vastgesteld bij een resolutie van 4 Å door middel van röntgenkristallografie van het enzymcomplex van Paracoccus denitrificans . Andere werden in 2015 en 2016 bepaald door cryo-elektronenmicroscopie van afzonderlijke deeltjes van de runderenzymen en schimmelenzymen, hoogstens bij 6 Å resolutie . Nochtans, missen deze modellen allen het detail dat Voor formulering van een moleculair mechanisme van de generatie van rotatie van de proton-drijfkracht wordt vereist, en, wegens de beweeglijkheid en de flexibiliteit van de enzymen, kunnen de enige deeltjes van het enzym vele verschillende posities aannemen. Daarom, het vormt een ongewoon moeilijk probleem voor de cryo-em aanpak.

figuur het membraandomein van de F-ATPase van P. angusta. In A-D is de A-subeenheid maisblauw. A en B, meningen in stevige vertegenwoordiging van de kant, en onder het membraandomein. De C10-ring is grijs, de B-subeenheid (bovenste deel niet getoond) is roze, en de lichtgele, baksteenrode, Licht Cyaan en beige segmenten zijn transmembrane α-helices, Ch1-Ch4 toegewezen aan subeenheid f, ATP8, aH1 en bH1, respectievelijk. In de C-ring geeft I-IV De vier transmembrane C-terminal α-helices aan in contact met subeenheid A. C en D, gezichtspunten van de A-subeenheid in solide en cartoon representatie van buitenaf bekeken en uitziend van de interface met de C-ring, respectievelijk met aH1 in licht cyaan. Geconserveerde polaire residuen zijn geel, de posities van menselijke mutaties geassocieerd met pathologieën (zie tabel S1) zijn rood. De Roze bol staat voor de behouden Arg-179 in aH5 die essentieel is voor de translocatie van proton. De onderste pijl geeft de inlaatroute aan voor protonen die overgaan op Glu-59 in de C-terminal α-helix-II van de C-ring. Zij worden rond de ring door tegen de wijzers van de klok in gedragen zoals van boven bekeken, totdat zij bij Arg-179 aankomen waar zij de uitgangspad ingaan, die door de hogere pijl wordt aangeduid.

structuren van bacteriële ATP synthases

figuur bacteriële ATP synthases. A) F1-ATPase van Caldalkalibacillus thermarum met 2,6 Å resolutie door röntgenkristallografie; B) ATP-synthase-enzym van Paracoccus denitrificans met 4 Å resolutie door röntgenkristallografie; C) ATP-synthase van Escherichia coli met 7 Å resolutie door cryo-EM.

in vergelijking met de uitgebreide studies die we hebben uitgevoerd op mitochondriale enzymen, zijn de structuren van bacteriële ATP synthases weinig onderzocht, met uitzondering van structuren van de F1 katalytische domeinen van de enzymen van Escherichia coli en Geobacillus stearothermophilus (voorheen Bacillus stearothermophilus) op respectievelijk 3.2 en 3.9 Å resolutie, en structuren van de c-ringen van hun membraandomeinen van verschillende soorten . Om deze lacune op te vullen, hebben we tot nu toe bijgedragen aan de structuur van het gehele enzym van Paracoccus denitrificans op 4 Å resolutie , en, in samenwerking met Professor G. M. Cook en collega ‘ s in Dunedin, Nieuw-Zeeland, de structuren van de F1 katalytische domeinen van de ATP synthases van Caldalkalibacillus thermarum, Fusobacterium nucleatum en Mycobacterium smegmatis. C. thermarum is een thermoalkaliphile, en de structuur van zijn katalytisch domein bij 2,6 Å resolutie is de meest nauwkeurige structuur van een bacteriële F1-ATPase nog bepaald . Het enzym van M. smegmatis is nauw verwant aan het enzym van M. tuberculosis. De structuur van zijn katalytisch domein is bepaald aan 4 Å resolutie en verstrekt een doel voor de ontwikkeling van nieuwe anti-tuberculaire drugs . Het opportunistische parodontale pathogeen, Fusobacterium nucleatum, wordt geassocieerd met een breed scala aan ziekten, waaronder orale infecties, vervroegde zwangerschapsuitkomsten, gastro-intestinale ziekten en atherosclerose. Ook is het in verband gebracht met de ontwikkeling en progressie van colorectale kanker via remming van anti-tumor immuunsignaalwegen en daaropvolgende bevordering van chemoresistentie. Het is een obligaat anaerobe en koppelt de vrije energie van decarboxylatie van glutaconyl-CoA aan crotonyl-CoA aan het transport van Na+ – ionen over zijn cellulaire membraan om een natriumionenmotieve kracht (smf) te genereren. Het ATP synthase gebruikt smf om de synthese van ATP te drijven die voor katabole en anabole reacties wordt vereist. De structuur van het F1-katalytische domein is bepaald bij een resolutie van 3,6 Å . Met behulp van cryo-EM is een kaart van het intacte ATP-synthase van E. coli gepubliceerd met de ε-subeenheid in de “up” positie (zie hieronder) , en onlangs is een structuur van het ATP-synthase van Geobacillus stearothermophilus vastgesteld op 3 Å .

Structure of parasite ATP synthases

figuur de F1-ATPase van Trypanosoma brucei. De subeenheden α -, β-, γ-, δ-, ε-en p18 zijn respectievelijk rood, geel, blauw, Groen, magenta en cyaan. (A en B) Cartoon voorstellingen van de zij-en bovenaanzichten; (C-E) oppervlakte voorstellingen van (C), de bovine F1-ATPase, (D), De T. brucei-enzym in grijs met P18 verwijderd en de gekleurde secties die de aminozuren naast het runderenzym tonen, en (E) het T. brucei-enzym met p18 aanwezig.

de structuren en functies van de componenten van ATP-synthases, met name die subeenheden die direct betrokken zijn bij de katalytische vorming van ATP, worden op grote schaal geconserveerd in metazoanen, schimmels, eubacteriën en plantchloroplasten. Op basis van een kaart op 32.5 Å resolutie in situ bepaald in de mitochondriën van de euglenozoïsche parasiet, Trypanosoma brucei, door elektron cryo-tomografie, werd voorgesteld dat het ATP-synthase bij deze soort een niet-canonieke structuur heeft met verschillende katalytische plaatsen, waar de katalytische essentiële argininevinger wordt geleverd, niet door de α-subeenheid naast de katalytische nucleotidebindingsplaats, zoals bij alle tot nu toe onderzochte soorten, maar door een eiwit genaamd p18 dat alleen in de euglenozoa wordt aangetroffen . In samenwerking met Drs Alena Zíková en Ondřej Gahura van het Instituut voor Parasitologie van České Budějovice in de Tsjechische Republiek, hebben we de F1-ATPase van T. brucei gekarakteriseerd en een kristalstructuur van het enzym bepaald met een resolutie van 3,2 Å . Deze structuur toont aan dat het voorstel dat het katalytische domein van dit ATP synthase een niet-canonieke structuur en verschillende katalytische plaatsen heeft onjuist is. In veel opzichten lijkt de structuur van T. brucei F1-ATPase sterk op die van eerder vastgestelde F1-ATPase. Het α3β3-sferische gedeelte van het katalytische domein, waar de drie katalytische locaties worden gevonden, plus de centrale stengel, zijn sterk geconserveerd, en de argininevinger wordt conventioneel geleverd door de α-subeenheden naast elk van de drie katalytische locaties in de β-subeenheden. Zo heeft het enzym een conventioneel katalytisch mechanisme. De structuur verschilt van eerdere door het hebben van een P18-subeenheid, alleen geïdentificeerd in de euglenozoa, geassocieerd met het buitenoppervlak van elk van de drie α-subeenheden, waardoor het F1-domein wordt uitgewerkt. Subunit p18 is een pentatricopeptide repeat (PPR) eiwit met drie PPRs en lijkt geen functie te hebben in het katalytische mechanisme van het enzym. T. brucei is de veroorzaker van slaapziekte bij mensen en verwante ziekten bij huisdieren die in Sub-Sahara Afrika leven, en de structuur van zijn F1-ATPases biedt een doel voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van de ziekte.

de rol van cardiolipine

het anionische lipide cardiolipine is een essentieel onderdeel van actieve ATP-synthases. In metazoanen bevatten hun rotoren een ring van acht C-subeenheden bestaande uit binnenste en buitenste cirkels van respectievelijk n – en C-terminale α-helices. Het begin van de C-terminale α-helix bevat een strikt geconserveerd en volledig trimethyleerd lysineresidu in de lipidekopgroep van het membraan. Grotere ringen van bekende structuur, van c9-c15 in eubacteriën en chloroplasten, behouden ofwel een lysine of een arginine residu in de gelijkwaardige positie. In computersimulaties van gehydrateerde membranen die trimethylated of unmethylated boviene c8-ringen bevatten, en bacteriële C10 – of c11-ringen, werden de hoofdgroepen van cardiolipinmoleculen selectief geassocieerd met deze gemodificeerde en ongewijzigde lysineresiduen en met aangrenzende polaire aminozuren, en met een tweede geconserveerde lysine aan de andere kant van het membraan, terwijl fosfatidyllipiden weinig naar deze plaatsen werden aangetrokken .

figuur manieren van binding van cardiolipine aan trimethyleerde c8-ringen. De N-en C-terminale α-helices van C-subeenheden zijn respectievelijk donker en lichtgrijs. Cardiolipinmoleculen zijn groen, met roze fosfaatgroepen. Grote gekleurde bollen vertegenwoordigen de grove korrelparels voor specifieke aminozuren, zoals aangegeven, die binnen 0,7 nm van de fosfaatparels van cardiolipine liggen. Delen A en B, De head-group regio van cardiolipine in de binnenste folder van het membraan gebonden, respectievelijk aan twee aangrenzende c-subeenheden (subeenheden 8 en 1), en aan een enkele c-subeenheid; deel C, een cardiolipin molecuul in de buitenste folder van het membraan gebonden aan een enkele c-subeenheid.

De verblijfstijden van cardiolipinemoleculen met de ring waren echter kort en voldoende om de rotor slechts een fractie van een graad in het actieve enzym te laten draaien. Met de gedemethyleerde C8-ring en met c10 – en c11-ringen nam de dichtheid van gebonden cardiolipinmoleculen op deze plaats toe, maar de verblijfstijden werden niet sterk veranderd. Deze zeer specifieke maar korte interacties met de roterende C-ring zijn consistent met functionele rollen voor cardiolipine in het stabiliseren en smeren van de rotor, en, door interactie met het enzym bij de inlaat en uitgang van het transmembraanprotonkanaal, in deelname aan proton translocatie door het membraandomein van het enzym.