FIGUR 1. Cytotoksisitetsanalyse og LD50-bestemmelse utført I Vero – cellekulturer. (A) Vero cellekultur Med Minimalt Essensielt Medium(Levedyktighetstest). (B) Vero cellekultur Med Craig Medium(Levedyktighet test). (C) Negativ kontroll med E. coli K12. (D) Positiv kontroll Med E. coli O157: H7, Cytotoksisk skade er vist (piler) ved ødeleggelse av cellemonolaget og» gammel blonder » effekt. (E) Cytotoksisk skade Av a. hydrofila f-0050 stamme. (F) Cytotoksisk skade Av a. caviae 421423 stamme. (G) Grafisk representasjon AV LD50 titer av alle stammer.RESULTATENE for bestemmelse AV LD50-titeren var som følger: 6/17 (35,2%) cellefrie bakteriepreparater presenterte en titer på 1:16; 5/17 (29,4%) cellefrie bakteriepreparater viste en titer på 1:8; 3/17 (17,6%) cellefrie bakteriepreparater hadde en titer på 1:64; 2/17 (11,7%) cellefrie bakteriepreparater med en titer på 1:32; og 1/17 (5,8%) cellefrie BAKTERIEPREPARATER MED en titer på 1:256 (figur 1g).

Toksin Nøytralisering

anvendelsen av anti-STX1 Ab i 11/17 (64 .7%) stammer skaden på cellene i supernatanten ble fullstendig hemmet ved 39,1 µ/µ ab-konsentrasjon; i 4/17 (23,5%) cellefrie bakteriepreparater ble det observert redusert celleskade ved samme konsentrasjon; og i 2/17 (11,7%) cellefrie bakteriepreparater ble celleskader fullstendig hemmet ved en konsentrasjon 78,2 µg/µ. Ved Bruk Av Ab anti-STX2 viste det seg at i 9/17 (52,9%) cellefrie bakteriepreparater ble celleskader fullstendig hemmet ved 37,4 µ/µ, og 6/17 (35,2%) cellefrie bakteriepreparater viste redusert celleskade i samme konsentrasjon; og i 2/17 (11.7%) cellefrie bakteriepreparater ble celleskader fullstendig hemmet med En ab-konsentrasjon på 74,8 µ/µ (Figur 2 og 3).

FIGUR 2. Hemming av cytotoksisk effekt indusert I Vero cellekultur ved cellefrie bakteriepreparater Av Aeromonas spp. stammer som bærer stx1-eller stx2-genet.

FIGUR 3. Prosent av stammer som viste hemming eller reduksjon av celleskader. (A) Nøytralisering med anti-Stx1 Ab. (B) Nøytralisering med anti-Stx2 Ab.

STX1 Genet PCR Forsterkninger fra OMVs

Polymerase kjedereaksjon Av OMVs’ DNA Av A. hydrophila F-0050 avslørte OMVs inneholdt gen stx1; derfor, OMVs kan være et potensielt redskap for horisontal virulens gener overføring (Figur 4).

FIGUR 4. Elektroferogram av stx1 genforsterkning FRA OMVs’ DNA. (1) Kapa Universell Stige, (2) Negativ kontroll, (3) Omv Av a. hydrofila F-0050, (4) a. hydrofila F-0050, (5) Omv Av E. coli O157:H7 og (6) E. coli O157: H7.

Diskusjon

slekten Aeromonas, som Produsent Av Stx, kan være et fremvoksende patogen som forårsaker diare hovedsakelig hos pediatriske pasienter (Hern@ndez-Cortez et al.(2011; Figueras Og Baez-Hidalgo, 2014). Likevel har denne slekten blitt mer relevant i det medisinske området, da det er et patogen som forårsaker HUS (San Joaquí og Pickett, 1988; Bogdanović et al., 1991; Robson et al., 1992; Fang et al., 1999; Monforte-Cirac et al., 2010).

i denne studien fant VI, VED PCR-forsterkning av stx1-og stx2-genene, at 22/66 (33.3%) av aeromonad-stammene inneholdt stx1-genet, 42/66 (63,6%) stammer inneholdt begge gener, og det var ingen stammer som inneholdt stx2 alene. Dette kan føre oss til å foreslå at dette genet er utbredt i Aeromonas-stammene isolert fra pediatriske pasienter, og at disse pasientene kan være i fare for å utvikle HUS.det er bare en tidligere rapport hvor stx-genene ble studert i Aeromonas-stammer isolert fra forskjellige sykehus i Spania; resultatene som ble oppnådd var at 19/80 (23,7%) stammer hadde stx1-genet og bare 1/80 (1.25%) stamme var positiv for begge gener(Alperi Og Figueras, 2010). Disse resultatene formidler at det er en større fordeling av genet i Meksikanske stammer; vi bør imidlertid ta hensyn til At I Spania Er Aeromonas-slekten et kjent gastrointestinalt patogen isolert rutinemessig hos pasienter med en gastrointestinal profil.

I Mexico er denne slekten ikke inkludert i listen over patogener som forårsaker diare, og den er ikke isolert rutinemessig; som et resultat er det vanskelig å gi noen behandling og god livskvalitet til pasienter; dessuten er det ingen statistikk om utbredelsen. I tillegg blir slekten mer relevant på grunn av de sosioøkonomiske forholdene til Den Meksikanske befolkningen, som inkluderer vannmangel; dette letter overføringen og øker muligheten FOR AT HUS blir et folkehelseproblem.Sekvensering av amplikonene ble utført og Et Blastsøk ble utført, som viste 79-99% likhet og en forventet verdi på 3e-16/2e-97 mellom gener stx1 / stx2 sammenlignet Med E. coli O157:H7.

LD50 ble bestemt for å evaluere cytotoksisk skade I Vero cellekultur; med denne parameteren og basert På Marques et al. (1986), kan stammene grupperes i lav (2 × 101 til 6 × 102), moderat (103-104) og høy (105-108) produksjon (Figur 1g). Marques et al. (1986) gjennomførte en studie der de gjorde en lignende analyse som i denne studien, men med forskjellige stammer AV STEC, oppnådde de at 262/400 (63%) stammer ble gruppert som lave stx-produsenter, og 48% produserte cytotoksisk skade; likevel, i 40% av disse stammene ble den cytotoksiske skaden hemmet med anti-Stx antistoffer.

i denne studien forårsaket 25,7% av bakteriefrie preparater cytotoksisk skade som er karakteristisk For Stx i Vero-celler, noe som tyder på produksjon av aktiv Stx, alle Aeromonas-stammer ble gruppert som lave produsenter Av Stx; i 50-70% av de cellefrie supernatantene ble den cellulære skaden hemmet, og i 20-30% av cellefrie supernatanter ble den cellulære skaden redusert (Figur 3). De cellefrie supernatanter hvor cellulær skade ble redusert dette kunne ha vært på grunn av to varianter i toksinet tilstede i supernatanten, derfor, da De er forskjellige immunologisk, Kunne Stx ikke bli helt hemmet og den cellulære skaden forble (Marques et al., 1986).

To tidligere studier (Haque et al., 1996; Alperi Og Figueras, 2010) oppnådde henholdsvis 10,2% og 10,53% av Stx1-produserende Aeromonas-stammer. Årsaken til en høyere prosentandel Av Aeromonas-stammer som produserer aktiv Stx, kan skyldes den høye tilgjengeligheten Av stx-bakteriofagen inne i kulturen, da NOEN STEC-stammer bærere Av Stx-bakteriofagen har blitt isolert fra urbane avløpsvann fra renseanlegg, avløpsvann fra slakterier og storfestoler (Garc@a-Aljaro et al., 2004, 2009). På samme måte har transduksjonsstudier blitt utført in vivo med Stx-fager Fra E. coli, som kan infisere tarmmikrobiotabakterier, noe som gir den toksigeniske egenskapen til stammer som ikke var infisert før (Acheson et al., 1998; Schmidt et al., 1999; Gamage et al., 2003). Det samme kan skje med Slekten Aeromonas når man induserer en gastrointestinal profil, etterfulgt av at slekten Aeromonas har evnen til å fange og integrere virulensfaktorer i sitt genom, og en Av disse Er Stx-kodende genet.resten av stammene forårsaket cytotonisk skade i cellen, noe som muligens tyder på produksjon av forskjellige toksiner enn Stx, siden Aeromonas er et slekt som er i stand til å produsere to cytotoniske enterotoksiner, termostabile (AST) og termolabile (ALT) (Figueras og Baez-Hidalgo, 2014), som kan forårsake cytotonisk skade I Vero-celler; En annen mulighet er At Aeromonas-stammene har mer enn en bakteriofag satt inn i deres genom, da DET har vist seg at STEC-stammer med dobbelt lysogeni er i stand til å regulere bakteriofager for å hemme kapasiteten til lytisk syklusinduksjon, noe som resulterer i en reduksjon Av Stx-produksjonen, men uten å miste genet (Garcauka-Aljaro et al.(2004; Imamovic Og Muniesa, 2011). Derfor er det nødvendig å fastslå hvor mange bakteriofager Aeromonas stammer inneholder, inkludert i denne studien, for å kunne korrelere tilstedeværelsen Av stx bakteriofager og mengden produsert Av Stx.på den annen side representerer tilstedeværelsen Av stx bakteriofager i inducerbare Aeromonas en horisontal overføringsmekanisme av stx-genet, men det er ikke den eneste. I nyere studier har Det blitt fastslått At Aeromonas er i stand til å produsere Omver (Guerrero-Mandujano et al., 2015a) og Disse Omvene er i stand til å transportere integrert DNA (Guerrero-Mandujano et al.( 2015b). I denne studien forsterket vi stx1-genet fra DNA ekstrahert fra Omvene av en a. hydrofila-stamme av klinisk opprinnelse, som induserte cytotoksisk skade I Vero-celler, og denne skaden ble hemmet med anti-Stx-antistoffer. Dette indikerer At stx-bakteriofagen er transportmekanismen til stx-genet; videre Er Omvene og Det nylig kalt Transportsystem type 0 i stand til å spre stx-genet interspecies eller intraspecies. Likevel er det nødvendig å bekrefte om genet i Omvene er fullført. Resultatene oppnådd i denne studien støtter hypotesen om at stx-genet er en annen antatt virulensfaktor Av Aeromonas som kan overføres gjennom OMVs. Det kan representere en annen mekanisme for horisontal transport av stx-genet til andre Aeromonas-stammer og / eller andre bakterielle slekter.

av denne grunn bør denne slekten inkluderes som mulig utløsende agent for gastroenteritt når man prøver å identifisere kausale midler og bør rapporteres som en del av standard helseovervåkningsprosedyrer.

Forfatterbidrag

IP-M og AG-M utførte forsøkene OG MR-R utførte bioinformatikkanalysene og utarbeidet manuskriptet; CH-C designet primeren; VB-G, OG JM-L kommenterte kritisk og revidert manuskriptet; GC-E oppfattet studien, deltok i design og koordinering, vurderte dataene og utarbeidet manuskriptet. Alle forfattere leste og godkjente det endelige manuskriptet. Vi vil gjerne takke Sofia Marteli Mulia for vennlig korrigere stilen på manuskriptet.

Midler

GC-E og VB-G fikk støtte fra Estímulos al Desempeño no Investigación og Comisión y Fomento de Actividades Académicas (Instituto Politécnico Nacional) og Sistema Nacional de Investigadores (SNI, CONACyT). Denne studien ble finansiert av Sekretariatet For Forskning og Doktorgrad Ved National Polytechnic Institute (SIP 20160609). SIP-IPN var ikke involvert i utviklingen av studiedesign, innsamling, analyse og tolkning av data, i skrivingen av rapporten eller i beslutningen om å sende papiret til publisering. IP-M og AG-M hadde stipend Fra CONACyT OG BEIFI.

Interessekonflikt

forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Takk

vi takker Dr. Patricia Arzate Barbosa for å gi stamme isolater og Dr. Armando Navarro for å gi de monoklonale antistoffene.

Forkortelser

Ab, Antistoff; HUS, Hemolytisk uremisk syndrom; Inp, Instituto Nacional De Pediatria Mexico; LD50, MEDIAN dødelig dose; OMVs, Outer membrane vesicles; PCR, Polymerase chain reaction; STEC, Shiga toxin-producing E. coli; Stx, Shiga-like toxin; TTP, Thrombotic thrombocytopenic purpura.