설명하고 일반 사항

제한 endonucleases(REs)세균 효소는 다니엘 두 번 DNA. 유형 I REs 는 박테리아 기능에 중요하지만 특정 서열에서 DNA 를 절단하지 않습니다. 이 설명서에 사용하기 위해 설명 된 TYPE II REs 는 DNA 분열을위한 매우 특정한 부위를 필요로하며 따라서 분자 생물학에서 매우 유용한 도구입니다. 이 효소는 정의 된 DNA 단편의 복제 및 정제를 허용합니다. 500 정도 공지된 REs 는 전형적으로 다양한 박테리아 균주로부터 분리된다.

REs 는 박테리아에 존재하여 특정 인식 부위에서 외래 DNA 를 절단하여 외래 공급원(예:박테리오파지 감염)으로부터 DNA 를 파괴합니다. 호스트 세균의 DNA 로부터 보호 협곡기 때문에 특정 인정 사이트,수정에 의해 일반적으로 메 틸에서 기지 중 하나 사이트에서,사이트를 만드는 더 이상의 기판 위해 다시 협곡. 실질적으로,해상도와 함께 다른 인식을 사이트의 특이성되었을 정화에서는 다양한 세균 균주에 의해 사용되는 분자 생물학에서 정의된 조건을 충실 정화에서 DNA 를 진 핵원으로 정의 조각에서 체외 반응입니다. 호스트 세균 전파하는 데 사용되는 DNA 복제 실험실에서는 일반적으로 돌연변이에서 호스트 제한 유전자(hsdR,hsdM,또는 hsdS);따라서 그들의 세포내 효소 활동을 파괴하지 않습니다 외국인 재조합니다.

이러한 끝이 보완(“끈끈한”)과될 수 있는 효소 다시 연결하는 모든 다른 EcoRI 생성 테르를 사용하여 T4DNA 리가입니다. 다른 해상도를 인식하는 다른 시퀀스를 만드는 독특한 cleavages 결과에 다른 정의된 테르,그 중 일부는 또한 5’돌출 끝,3’돌출 끝나거나,아니 튀어나온(둔)종료(참조 Table5.1). 각각의 재는 인식 부위를 생성하는 데 필요한 특정 서열 및 뉴클레오타이드 수를 갖는다. 일부 REs 는 인식 부위의 모든 위치에 특정 뉴클레오타이드를 필요로하지 않습니다. 예를 들어,어떤 경우에는 정의 된 위치에있는 퓨린 뉴클레오타이드(A 또는 G)로 충분합니다. 는 주파수는 다시는 것 절단 DNA 따라서 관련 번호의 기지에서 인식을 시퀀스(면 더 기초가 필요한 적은 상처는 apt 만들 수)와 특정한 기지에 위치입니다.

해상도 유용하기 때문에 그들의 특이성 및 결과 ligatable 테르미니이도록 해부,분석 및 구조 조정의 DNA 를 제어,예측,특정 사이트의 방식이다. 기 때문에 그들은 효소,각각 특정 요구 사항에 대한 조건에 선도하는 최적의 분열 활동입니다. 다행히도,많은 것은 기본 변수가 이온 강도(즉,버퍼의 NaCl)인 유사한 조건에서 활성화됩니다. 실용적인 조건은 연구 도구로 각 재를 사용하기 위해 경험적으로 정의되었습니다.

재 활성의 양은 일반적으로 고전 효소 동역학을 사용하여 정의되지 않는다. 오히려 재 활동은 실험실에서 사용하기위한 실용적인 용어로 정의됩니다. 하나의 단위(U)의 활동에 대해 다시 일반적으로 금액으로 정의의 효소는 1µg 에는 모든 특정 사이트에서 DNA 샘플(일반적으로 박테리오파지 λ)에서 1 시간 37°C 추가 재 소화 사이트가있는 경우 달성 실제 활동은 다를 수 있습니다. 예를 들어,1 인 경우 U 의시하기에 충분하 컷 1µg 의 박테리오파지 λ DNA 완전히 하나의 사이트에서 아래 표준 시험 조건,그것을 할 수 없을 완전히 절단 1µg 의 DNA 샘플는 네 개의 사이트에 대한시,또는 샘플이 있는지 충분히 순화 된다.

반응 조건에 관한 다른 요인들도 재 활성에 영향을 미친다. 여기에는 DNA 의 순도,완충액,온도 조건 및 RE 자체가 포함됩니다. 점성 용액에서 DNA 메틸화,결합 단백질 또는 고 분자량 DNA 의 과도한 점도는 재 다이제스트의 효율을 감소시킬 수 있습니다. 절단 될 DNA 는 일반적으로 불순물이 없어야한다;SS-페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전(섹션 20-1)은 많은 방해 불순물을 제거합니다. 대조적으로,대부분의 REs 는 일반적으로 rna 또는 단일 가닥 DNA 에 의해 악영향을받지 않습니다. 따라서,coprecipitant 로서 tRNA 의 첨가는 후속 RE 다이제스트에 영향을 미치지 않으면 서 소량의 DNA 를 회수하는데 유용 할 수있다.

전형적인 분석 결과 조건에 대해 다시 반응을 포함 버퍼(10mm Tris,pH7.4 는 것이 일반적이다),10mM Mg2+료의 실질적인 농도의 키일레이트성 약제(TE 버퍼를 포함한 충분히 낮은 양의 EDTA). 재 완충액은 또한 각각의 재에 대해 최적의 이온 강도를 부여하기 위해 적절한 염 농도를 함유한다. 어떤 경우에는 bsa,DTT 및 스 페르 미딘이 첨가되어 최적의 효소 활성을 제공합니다. 네 일반화 재 버퍼는 대부분의 REs 에 대한 요구 사항을 만족시킬 수,이러한 버퍼의 10×주식의 사전 준비는 아래에 설명되어 있습니다. 대부분의 재 소화는 taqi 와 같은 몇 가지 예외가 있지만 37°C 에서 수행됩니다.

대부분 구입 한 고해상도 함께 제공되는 적절한 저장 버퍼지만,이 포함되는 25~50%글리세롤을 동결 방지하는 동안 스토리지 -20°C 농도의 글리세롤의 5%이상(vol/vol)에서 다시 소화를 분석할 수 있습을 억제 활동의 많은 해상도입니다. 또한,높은 글리세롤의 농도는 동안 다시 소화가 휴식을 취할 수 있습 순서 특이성의 몇 가지 고해상도의 결과로,가짜 cleavages. 예를 들어,이러한 현상은 함께 볼 수있는 일반적으로 사용되는 재 EcoRI,어디로 가짜 활동에서 관찰 하는 일부 조건이라고 EcoRI*(성급)활동입니다. 이러한 이유로,그것은 중요한의 볼륨을 만들려면 다시 소화 반응을 충분히 큰을 포함하는 적어도 1:10 의 희석시 자체(따라서 줄의 글리세롤의 농도). 기타 요인 등의 pH,에탄올,또는 부적절한 소금을 집중력을 일으킬 수도 있습타 활동이나 활동을 감소;따라서,주의 준수를 권장 조건이 중요합니다.

몇 가지 다른 고려사항은 사용할 때 유용 REs. 를 사용하는 새로운 피펫 팁은 각 시간을 다시 전송됩니다. 재 스톡에 첨가 된 미량의 오염 물질은 추가 사용을 방지하고 후속 실험에서 얻은 결과를 혼동시킬 수 있습니다. 할 때 최적화 반응,그것은 더 나은 추가하려면 다시 이상을 품에 대한 보다 훨씬 더 이상 1hr. 또한,위에서 언급한 바와 같이,효소 활동을 정의에 대해서만 절단 DNA 표준입니다. 기 때문에 당신의 샘플은 일반적으로 매우 다른 표준에서,좋은 가이드를 사용하는 것에 대해 2-3U 의 재당 그램의 DNA 를 잘리고,특히 시도할 때 소화하기 곤란한 샘플입니다. DNA 샘플을 적절히 소화하는 데 필요한 re 의 양을 적정하는 것이 때때로 필요할 수 있습니다.

마지막으로 두 개의 REs 를 사용해야하는 경우 각각의 최적 소금 조건에주의를 기울여야합니다. 둘 다 동일한 버퍼를 필요로하는 경우 소화를 동시에 또는 순차적으로 수행 할 수 있습니다. 다른 소금 조건이 요구되는 경우에,더 적은 소금을 요구하는 재는 첫째로 사용되어야 합니다. 배양 후 소금 상태를 조정하고,높은 소금을 필요로하는 재와 소화. RE 활성은 모든 경우에 SS-페놀/클로로포름 추출에 의해 제거 될 수있다. 일부 REs 는 thermolabile 이며 5 분 동안 70°C 로 가열하여 불 활성화 될 수 있습니다. 이 속성은,그러나,다음 하나 다시 다르며 사용 된 각 재에 대해 확인되어야한다.