説明と一般的な注意事項

制限エンドヌクレアーゼ(REs)は、二本鎖DNAを切断する細菌酵素である。 Ｉ型Ｒｅは、細菌の機能において重要であるが、特定の配列でＤＮＡを切断しない。 このマニュアルで使用するために記載されているＩＩ型Ｒｅは、ＤＮＡ切断のために非常に特異的な部位を必要とするので、分子生物学において非常に有用 これらの酵素は、定義されたDNA断片のクローニングおよび精製を可能にする。 ５ ０ ０程度の既知のＲｅは、典型的には、種々の細菌株から単離される。REsは、特定の認識部位で外来DNAを切断することにより、外来源からのDNAを破壊する（例えば、バクテリオファージに感染する）と考えられる細菌に存在する。

宿主細菌のDNAは、特定の認識部位が通常、部位内の塩基のいずれかでメチル化によって修飾され、部位がもはや再切断のための基質ではないため、開 実際には、異なる認識部位特異性を有するREsは、様々な細菌株から精製されており、in vitro反応で定義された断片に真核生物源から精製されたDNAを切断す 実験室でクローニングされたDNAを伝播するために使用される宿主細菌は、通常、宿主制限遺伝子（hsdR、hsdM、またはhsdS）の変異体であり、したがって、それらの細胞内多くのＲｅの切断部位特異性が定義されている。

これらの末端は相補的（「粘着性」）であり、ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて他の任意のＥｃｏＲＩ生成末端に酵素的に再付着させることができる。 他のＲｅは、異なる配列を認識し、独特の切断を生じ、他の定義された末端を生じ、そのうちのいくつかは、５’突出末端、３’突出末端、または突出（平滑）末端を有 各ＲＥは、認識部位を作成するために必要な特定の配列および数のヌクレオチドを有する。 いくつかのＲｅは、認識部位のすべての位置に特定のヌクレオチドを必要としない。 例えば、いくつかの場合には、定義された位置にあるプリンヌクレオチド（ＡまたはＧ）で十分である。 したがって、ＲＥがＤＮＡを切断する頻度は、認識配列中の塩基の数（より多くの塩基が必要とされる場合、より少ない切断がなされがちである）および任意の位

REsは、その特異性と結果として得られる連結可能な末端により、制御された予測可能な部位特異的な方法でDNAの解剖、分析、および再構築を可能にす それらは酵素であるため、それぞれが最適な切断活性をもたらす条件のための特定の要件を有する。 幸いなことに、多くは同様の条件下で活性であり、主な変数はイオン強度（すなわち、緩衝液中のNaCl）である。 各ＲＥを研究ツールとして使用するための実用的条件は経験的に定義されている。

RE活性の量は、通常、古典的な酵素速度論を用いて定義されていない。

むしろ、RE活性は、実験室での使用のための実用的な用語で定義される。 REの活性の1単位（U）は、通常、37℃で1時間でDNAサンプル（通常はバクテリオファージγ）中のすべての特定の部位で1μ gを切断する酵素の量として定義される。 達成される実際の活性は、追加のＲＥ消化部位が存在する場合、異なる可能性がある。 例えば、標準アッセイ条件下で１つの部位で１μ ｇのバクテリオファージγ ＤＮＡを完全に切断するのに１ＵのＲＥが十分である場合、ＲＥのための４つの部位を有

反応条件に関する他の要因もまた、RE活性に影響を与える。

これらには、ＤＮＡの純度、緩衝液、温度条件、およびＲＥ自体が含まれる。 DNAメチル化、結合タンパク質、または粘性溶液中の高分子量DNAの過剰な粘度は、RE消化の効率を低下させる可能性がある。 切られるべきDNAは通常不純物がないべきです;SSフェノール/クロロホルムの抽出およびエタノールの沈殿物（セクション20-1）は多くの干渉の不純物を取 対照的に、ほとんどのＲｅは、通常、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡによって悪影響を受けない。 従って、共沈剤としてのｔＲＮＡの添加は、後続のＲＥ消化に影響を及ぼすことなく、少量のＤＮＡを回収するのに有用であり得る。

RE反応の典型的なアッセイ条件は、緩衝液（10mM Tris、pH7.4が一般的）、10mM Mg2+を含み、実質的な濃度のキレート剤を含まない（TE緩衝液は十分に低い量のEDTA ＲＥ緩衝液はまた、各ＲＥに対して最適なイオン強度を与えるために適切な塩濃度を含む。 場合によっては、最適な酵素活性を提供するために、ＢＳ Ａ、ＤＴＴ、およびスペルミジンが添加される。 四つの一般化されたREバッファは、ほとんどのREsの要件を満たすことができ、これらのバッファの10×ストックの事前準備は以下に記載されています。 ほとんどの再消化は37℃で行われますが、TaqIなどのいくつかの例外があります。

ほとんどの購入されたREsは適切な貯蔵の緩衝と出荷されますが、これは-20°c.の貯蔵の間に凍結を防ぐために25-50%のグリセロールを含んでいます5%(vol/vol)上のグリセロールの集中はRE消化力の試金の多くのres.さらにの活動を禁じることができます、RE消化力の間の高いグリセロールの集中は偽の開裂に終ってあるresの順序の特定性を、緩めることができます。 例えば、この現象は、一般的に使用されるRE EcoRIで見られ、いくつかの条件下で観察されるスプリアス活性はEcoRI*（スター）活性と呼ばれます。 これらの理由から、ＲＥ消化反応の容積を、ＲＥ自体の少なくとも１：１ ０希釈を包含する（したがってグリセロール濃度を低下させる）のに十分な大きさにするこ PH、エタノール、または不適切な塩濃度などの他の要因も、star活性または活性低下を引き起こす可能性があるため、推奨条件を慎重に遵守することが重要

REsを使用するときには、他にもいくつかの考慮事項が役立ちます。REが転送されるたびに新しいピペットチップを使用してください。 REストックに添加された微量の汚染物質は、そのさらなる使用を防ぎ、その後の実験で得られた結果を混乱させる可能性があります。 反応を最適化するときは、1時間よりもはるかに長い間インキュベートするよりもREを追加する方が良いです。 あなたのサンプルは一般的に標準とはかなり異なっているので、特に困難なサンプルを消化しようとするときには、DNAのマイクログラムあたり約2-3UのREを切断することをお勧めします。 ＤＮＡ試料を適切に消化するために必要なＲＥの量を滴定することが時々必要であり得る。

最後に、二つのREsを使用する場合は、それぞれの最適な塩条件に注意する必要があります。 両方が同じ緩衝を要求すれば、消化は同時にまたは順次にすることができる。 異なった塩の条件が要求されれば、より少ない塩を要求するREは最初に使用されなければなりません。 培養後、塩の状態を調整し、高塩を必要とするREで消化します。 Ｒ ｅ活性はＳ ｓ-フェノール／クロロホルム抽出により全ての場合に除去できる。 あるREsはthermolabile、5分の70°Cに熱することによって不活性にすることができます。 ただし、このプロパティは1つのREから次のREに変化し、使用されるREごとに検証する必要があります。