leírás és általános megjegyzések

restrikciós endonukleázok (REs) olyan bakteriális enzimek, amelyek hasítják a kettős szálú DNS-t. Az I. típusú REs fontos a bakteriális funkcióban, de nem hasítja le a DNS-t specifikus szekvenciákon. Az ebben a kézikönyvben leírt II. típusú REs nagyon specifikus helyszíneket igényel a DNS hasításához, ezért rendkívül hasznos eszközök a molekuláris biológiában. Ezek az enzimek lehetővé teszik a meghatározott DNS-fragmensek klónozását és tisztítását. Az 500 vagy úgy ismert REs-t jellemzően különféle baktériumtörzsekből izolálják.

REs vannak jelen a baktériumok feltehetően, hogy elpusztítsa a DNS-t idegen forrásokból (például, megfertőzi bakteriofág) hasításával az idegen DNS specifikus felismerési helyeken. A gazdabaktériumok DNS-e védve van a hasadástól, mivel a specifikus felismerési helyek módosulnak, általában metilezéssel a hely egyik bázisán, így a hely már nem szubsztrát az újbóli hasításhoz. Gyakorlatilag a különböző felismerési helyspecifikus REs-t különböző baktériumtörzsekből tisztították, és a molekuláris biológusok meghatározott körülmények között használják, hogy az eukarióta forrásokból tisztított DNS-t in vitro reakcióban meghatározott fragmensekké hasítsák. A klónozott DNS laboratóriumban történő terjesztésére használt gazdabaktériumok általában mutánsak a gazdaszervezet restrikciós génjeiben (hsdR, hsdM vagy hsdS); így intracelluláris enzimaktivitásuk nem pusztítja el a külföldi rekombináns szekvenciákat.

Ezek a célok pedig a kiegészítő (“ragacsos”) lehet enzimesen újra, hogy más EcoRI-generált termini segítségével T4 DNS ligase. Más REs felismeri a különböző szekvenciák, hogy egyedi ilyen törésvonal eredő egyéb meghatározott található, amelyek egy része is 5′ kiálló szálakat, 3′ kiálló szálakat, vagy nincs kiálló (tompa) végén (lásd az 5.1 Táblázat). Minden RE-nek van egy meghatározott szekvenciája és számú nukleotidja, amelyek szükségesek a felismerési hely létrehozásához. Egyes REs-ek nem igényelnek specifikus nukleotidot a felismerési hely minden helyzetében. Például bizonyos esetekben elegendő egy purin nukleotid (a vagy G) egy meghatározott helyzetben. Az a gyakoriság, amellyel a re csökkenti a DNS-t, így kapcsolódik a felismerési szekvenciák bázisainak számához (ha több bázisra van szükség, kevesebb vágásra van szükség), valamint a konkrét bázisokhoz bármilyen helyzetben.a

REs azért hasznos, mert specifikusságuk és az így létrejövő ligálható termini lehetővé teszi a DNS boncolását, elemzését és átalakítását ellenőrzött, kiszámítható, helyspecifikus módon. Mivel enzimek, mindegyiknek különleges követelményei vannak az optimális hasítási aktivitáshoz vezető körülményekre. Szerencsére sokan hasonló körülmények között aktívak, az elsődleges változó Ionos szilárdság (azaz NaCl a pufferben). Gyakorlati feltételek már empirikusan meghatározott használata minden újra, mint egy kutatási eszköz.

A RE aktivitás mennyiségét általában nem határozzák meg klasszikus enzim kinetika alkalmazásával. Inkább RE tevékenység meghatározása gyakorlati szempontból használható a laboratóriumban. A RE aktivitásának egy egységét (U) általában úgy definiálják, mint az enzim mennyiségét, amely 1 µg-ot minden DNS-mintában (általában λ bakteriofág) 1 órán át 37°C-on vágja le. Az elért tényleges aktivitás eltérő lehet, ha további emésztési helyek vannak jelen. Például, ha 1 U az egy RE elegendő vágva 1 µg bacteriophage λ DNS teljesen egyik helyszínen alatt szabványos vizsgálat körülmények között, nem lehet tudni, hogy vágja teljesen 1 µg DNS-minta, hogy négy oldalak egy ÚJRA, vagy egy minta, hogy nem kellően tisztított.

a reakcióviszonyokra vonatkozó egyéb tényezők szintén befolyásolják a reaktivitást. Ezek közé tartozik a DNS tisztasága, puffer, hőmérsékleti körülmények, valamint maga a RE. DNS metilezés, kötött fehérje, vagy a nagy molekulatömegű DNS túlzott viszkozitása viszkózus oldatokban csökkentheti az újbóli emésztés hatékonyságát. A levágandó DNS-nek általában szennyeződéstől mentesnek kell lennie; az SS-fenol / kloroform extrakció és az etanol kicsapódása (20-1.szakasz) számos zavaró szennyeződést eltávolít. Ezzel szemben a legtöbb REs-t általában nem befolyásolja hátrányosan az RNS vagy az egyszálú DNS. Így a tRNA koprecipitánsként történő hozzáadása hasznos lehet kis mennyiségű DNS visszanyerésében anélkül, hogy befolyásolná a későbbi újbóli emésztést.

az ismételt reakció tipikus vizsgálati állapota puffert tartalmaz (10 mM Tris, a pH 7, 4 gyakori), 10 mM Mg2+, és mentes a kelátképző szerek jelentős koncentrációjától (a te puffer elég alacsony EDTA-t tartalmaz). Az újra pufferek is tartalmaznak megfelelő sókoncentráció, hogy az optimális Ionos szilárdság Minden RE. Bizonyos esetekben a BSA, a DTT és a spermidin adása biztosítja az optimális enzimaktivitást. Négy generalizált újra pufferek megfelelnek a követelményeknek a legtöbb REs, valamint az előzetes előkészítése 10 × készletek ezen pufferek az alábbiakban ismertetjük. A legtöbb újbóli ásatások végzik 37°C-on, bár van néhány kivétel, mint például a TaqI.

a Legtöbb vásárolt REs szállítják a megfelelő tároló puffer, de ez tartalmaz 25-50% glicerin, hogy megakadályozzák a hideg tárolás során -20°C-os Koncentrációban glicerin több, mint 5% (vol/vol) RE emésztés vizsgálatok gátolja a tevékenység sok REs. Emellett magas glicerin koncentráció alatt ÚJRA emésztés pihenhetnek a sorozat sajátossága néhány REs, ami hamis ilyen törésvonal. Például ez a jelenség látható az általánosan használt re EcoRI-val, ahol a bizonyos körülmények között megfigyelt hamis tevékenységet EcoRI * (csillag) aktivitásnak nevezik. Ezen okok miatt fontos, hogy a re emésztési reakció térfogata elég nagy legyen ahhoz, hogy magában foglalja a RE legalább 1:10 hígítását (és ezáltal csökkentse a glicerin koncentrációját). Más tényezők, például a pH, az etanol vagy a nem megfelelő sókoncentráció csillagaktivitást vagy csökkent aktivitást is okozhatnak; ezért fontos az ajánlott feltételek gondos betartása.

néhány egyéb megfontolás hasznos a REs használatakor.használjon új pipettacsúcsot minden alkalommal, amikor újra átkerül. Az ÚJRAÁLLOMÁNYHOZ hozzáadott szennyezőanyag nyomokban megakadályozhatja annak további felhasználását, és összezavarhatja a későbbi kísérletekben kapott eredményeket. A reakciók optimalizálásakor jobb, ha további RE-t adunk hozzá, mint az 1 óránál hosszabb inkubáláshoz.továbbá, amint fentebb említettük, az enzimaktivitást csak a DNS-szabvány vágására határozzák meg. Mivel a minta általában meglehetősen eltér a szabványtól, egy jó útmutató az, hogy körülbelül 2-3 U újra per mikrogramm DNS kell vágni, különösen, ha megpróbálja megemészteni egy nehéz mintát. Néha szükség lehet A DNS-minta megfelelő emésztéséhez szükséges újra mennyiségének titrálására.

végül, ha két REs-t kell használni, figyelmet kell fordítani az egyes só optimális körülményeire. Ha mindkettő ugyanazt a puffert igényli, az emésztést egyszerre vagy egymás után lehet elvégezni. Ha különböző sófeltételekre van szükség, először a kevesebb sót igénylő újra kell használni. Az inkubálás után állítsa be a só állapotát, majd megemésztse a magas sót igénylő újra. RE aktivitás lehet távolítani SS-fenol / kloroform extrakcióval minden esetben. Néhány REs termolabil, és inaktiválható 70°C-ra 5 percig történő melegítéssel. Ez a tulajdonság azonban változik az egyik újra a másikra, és ellenőrizni kell az egyes újra használt.