egyetlen alapozó kiterjesztés hozta létre az ss-dsDNAs-t. (Alsó) 4 ciklus PCR generált az optimális mennyiségű 160 nt ss-dsDNAs miközben minimalizálja a felesleges ssdna termelés. (Jobbra) a DNS-gél az ss-dsDNAs generációjának jelentős növekedését mutatta 1:10 ssDNA:primer Arány alatt. b egyedi fájlokat lehet elválasztani egy három fájl adatbázis által létrehozott egy pot egyetlen primer kiterjesztés. Minden fájlt a megfelelő biotin-kapcsolt oligo kötötte, majd egy nem PCR-alapú elválasztás funkcionális mágneses gyöngyökkel. A File separation specificitás az a, b vagy C fájl által elválasztott DNS százalékos aránya a qPCR által mérve. a c (balra) PCR, de nem DORIS lehetővé teszi az oligosz számára, hogy a belső off-target helyszíneket megkösse és nemkívánatos termékeket állítson elő. (Középső) DNS-gélek és (jobb) számszerűsített fluoreszcenciájuk (kék a PCR-hez, rózsaszín a DORIS-hoz) azt mutatta, hogy a PCR-alapú hozzáférés csonkolt és nem kívánt amplikonokat eredményezett, míg a DORIS csak a kívánt szálakat érte el. d (balra) Monte Carlo szimulációk becsült száma oligos talált, amelyek nem lépnek kölcsönhatásba egymással,vagy az adatok hasznos. 400 000 oligost teszteltek különböző sűrűségű kódolások ellen. Az x-tengely a sűrűséget (Eq. (4)), amely fordítottan kapcsolódik a diszkrét egy bájtos adatértékek tárolására használt kódszavak hosszához. A kódszó hosszát 12-től 4-ig értékeltük. DORIS esetében a kódolási sűrűség nem volt hatással, mert nem kell védenie az oligoszok és az adatterhelések közötti nem kívánt kötődés ellen. (Jobb) a PCR esetében az oligoszok száma, amelyek nem kötik össze az adat hasznos terhelését, csökken a szálsűrűség növekedésével, ami azt jelenti, hogy kevesebb fájl tárolható, ami alacsonyabb általános rendszerkapacitást eredményez. A DORIS esetében az oligos elérhetősége független a kódolástól, ezért a kapacitás sűrűbb kódolással növekszik. A ábrázolt értékek az aritmetikai átlagot, a hibasávok pedig a három replikált fájlelválasztás vagy szimuláció s.d. értékét képviselik. A gélképek reprezentatívak az RT-QPCR által mért három független kísérletre. A forrásadatok Forrásadatfájlként vannak megadva. * A kapacitásokat korlátozhatják a szintézis és a szekvenálás korlátai, amelyeket itt nem számolunk el.

ezután megvizsgáltuk, hogy ez a módszer használható-e 3 különálló ss-dsDNAs létrehozására egy Potos reakciókban, és ha minden ss-dsDNA külön elválasztható-e a keveréktől (ábra). 2b). 3 különálló ssDNAs “A”, “B” és “C”-t kevertünk össze, hozzáadtuk a közös alapozót, és 4 PCR ciklust végeztünk az ss-dsDNAs létrehozásához (itt csak egy egyedi szálból álló fájloknak nevezzük). Ezután biotin-linked 20 nt DNS oligos-t használtunk az egyes ss-dsDNS-ek (azaz, minden fájl, A, B, és C egy külön túlnyúlási szekvencia vagy fájl címét), és elválasztjuk őket a keverék segítségével mágneses gyöngyök funkcionalizált streptavidin. Mindegyik oligos képes volt külön csak a megfelelő fájlt különíteni a másik kettő nélkül (ábra. 2b, alsó, Eq. (1)). Fontos megjegyezni, hogy ezt az elválasztási lépést szobahőmérsékleten (25 °C) lehet elvégezni, csak minimális nyereséggel, amelyet magasabb oligo lágyítási hőmérsékleten figyeltek meg 35 vagy 45 °C (kiegészítő ábra. 2, ek. (2)). Ennek a lépésnek a szobahőmérséklete és Izotermikus jellege hasznos a gyakorlati DNS-tároló rendszerekben, valamint a DNS lebomlásának csökkentésében.

Míg 20 nt egy szabványos PCR primer hossza, megkértük, ha az elválasztás hatékonyságának lehet árnyalja a különböző túlnyúlás hosszúságú szétválasztás a hőmérséklet. Terveztünk 5 ss-dsDNAs 5-25 nt túlnyúlások (kiegészítő ábra. 3). Ezután 15-55 °C-on különítettük el az egyes szálakat a specifikus biotinnal összekapcsolt oligo segítségével. Megfigyeltük a hosszabb oligos (20mers és 25mers), valamint alacsonyabb hőmérsékleten (15 °C és 25 °C, kiegészítő ábra. 3b). Ez egyetértett egy termodinamikai elemzéssel az oligonukleotid tulajdonságok számológépével (kiegészítő ábra. 3C, módszerek, Eqs. (3)–(5))28,29,30.

DORIS növeli sűrűség kapacitás korlátok

az Egyik lehetséges előnye, hogy szobahőmérsékleten separations a fájlokat, hogy a kettős szálú részeit az ss-dsDNAs továbbra is lágyítják együtt lehet blokkolni kívánt oligo kötelező, hogy minden hasonló szekvencia adatok hasznos régiók. Az SS-dsDNAs közepén az adatterhelési régió a sorozat nagy része, amely tartalmazza a tárolt információkat. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez két ss-dsdnát hoztunk létre (ábra. 2c). Az egyik ss-dsDNA-nak volt egy túlnyúlása, amely az oligo a “- t és az oligo B ” belső kötőhelyét kötötte össze. Kísérletileg ellenőriztük, hogy a DORIS használatával csak az oligo a “de nem az oligo B” választhatja el a szálat. Összehasonlításképpen, a PCR-alapú rendszerek minden ciklusban megolvasztják a dsDNAs-t, lehetővé téve az alapozók számára, hogy az adat hasznos terhelésen belül Kössék le a célt. Ahogy az várható volt, amikor PCR-t használtak, mind az oligo a”, mind az oligo B “kötött, az oligo B” nem kívánt csonka termékeket állít elő. A második vizsgált szálnak volt egy belső kötőhelye és túlnyúlása, amely mindkettő kiegészítette az oligo C ‘ – t. Megmutattuk, hogy a DORIS használatával az oligo C ‘ csak a teljes hosszúságú szálat hozta létre. Ezzel szemben a PCR használatakor az oligo C ‘ mind a teljes hosszúságot, mind a csonka szálakat létrehozta.

ezután megkérdeztük, milyen következményekkel jár ez a DORIS blokkoló tulajdonsága a DNS-alapú információ tárolására. Ahogy az adatbázisok mérete növekszik, intuitív módon növekszik annak valószínűsége, hogy az adatterhelési régiókban megjelenő, a címsorokkal azonos szekvenciák (vagy a DORIS vagy a PCR alapozó oldalainak túlnyúlása) jelennek meg. A DORIS esetében ez nem jelent problémát, mivel az oligos blokkolja a dsDNA adatterhelési régiók kötését. A PCR-ben azonban a primerek kötik ezeket az adatterhelési régiókat, így a korábbi megközelítések olyan kódolási algoritmusokat fejlesztettek ki,amelyek korlátozzák az alapozó szekvenciákat (címeket) az átfedéstől az azonos vagy hasonló szekvenciákkal az adatterhelésekben11, 12, jellemzően elkerülve a Hamming távolságokat ~<6. Ez természeténél fogva csökkenti azt a sűrűséget, amellyel az adatbázisok kódolhatók az adatterhelési szekvencia helyének korlátozása miatt, vagy azok kapacitását a felhasználható egyedi primer szekvenciák számának csökkenése miatt. A sűrűség az NT-nként tárolt információk mennyisége (Eq. (6)), és csökken, mivel a kódolási korlátozások korlátozzák, hogy mely szekvenciákat lehet használni a hasznos terhelési régióban (alacsonyabb Sokszínűségi szekvencia tér), míg a kapacitás a rendszerben tárolható információk teljes mennyisége (Eq. (7)) függ a rendelkezésre álló címek számától, mivel ezek diktálják a tárolható fájlok számát.

mutatják, Hogy ezek a kapcsolatok mennyiségi, jelenleg megoldhatatlan, hogy analitikusan megoldani, vagy átfogóan kiszámítja a szám címét, hogy nem lép kölcsönhatásba az adatok hasznos régió, még mérsékelten méretű adatbázisok. Ezért Monte Carlo szimulációkat végeztünk, hogy megbecsüljük a címek számát és az elérhető összes kapacitást. A címszekvenciákat (PCR) vagy nem (DORIS) zárták ki, ha EGY 109 különálló DNS-szálú adatbázis adatterhelési régióiban jelentek meg (ábra. 2D, módszerek). Az elemzés egyszerűsítése érdekében számítási kódszavakat használtunk az adatterhelési régió kódolásához. Minden kódszó egy különálló nt-szekvencia, amely egy bájt (B) digitális információt tartalmaz. Az adatterhelési régió sűrűbbé tehető a kódszavak méretének csökkentésével, így több kódszó (és bájt) illeszkedik az egyes rögzített hosszúságú szálakba. A kompromisszum az, hogy a kisebb kódszavak is növeli a szekvencia sokszínűségét a szálak (a számos lehetséges különálló szekvenciák per szál hossza) miatt több kódszó-kódszó csomópontok per szál. Ez növeli annak esélyét, hogy hasonló szekvenciák jelenjenek meg a hasznos teherben, amelyek ütköznek a címszekvenciákkal.

a szimuláció azt vizsgálta, hogy a címszekvenciák ütköznek-e a hasznos adat bármely szekvenciájával. DORIS esetében azonban, még akkor is, ha a címszekvenciák ütköztek a hasznos teherrel, ezek a címek megengedettek voltak. A szimuláció tehát azt mutatta, hogy a hasznos információk sűrűség volt kal csökken kód hossza, a szám címét nem változott a DORIS, mivel nincs korlátozás elhelyezett címek más, mint hogy ők nem engedték, hogy hasonló egyéb címek (Fig. 2D, balra, rózsaszín). Ahogy az várható volt, ahogy a hasznos adatsűrűség nőtt, az adatbázis kapacitása monoton módon nőtt, mivel a fájlcímek száma ugyanaz maradt, mint a fájlonkénti szálak száma (ábra. 2d, jobb, rózsaszín). Ezzel szemben a PCR esetében kizárták azokat a címeket, amelyek bármilyen adatterhelési sorrendben megjelentek; az eredmény az volt, hogy a hasznos adatok sűrűségének növelése kezdetben csekély előnyt jelentett a teljes kapacitáshoz (ábra. 2d, jobb, kék), de végül katasztrofális kapacitáscsökkenéshez vezetett, mivel a címek száma, amelyek nem ütköztek semmilyen hasznos sorrenddel, gyorsan nullára esett (ábra. 2D, balra, kék). Bár lehetséges, hogy növelje a számát különböző szálak címenként (azaz., fájlonkénti információ) a címek elvesztésének pótlására, ez azt eredményezné, hogy a fájlok túl nagyok ahhoz, hogy egy szekvenáló run17-ben dekódolhassák őket. Fontos megjegyezni azt is, hogy szimulációink nagyon konzervatív kódszó sűrűségeken és csak 109 DNS-szál adatbázisméreten alapultak, míg a jövőbeli tárolórendszerek valószínűleg meghaladják az 1012 szálakat vagy annál nagyobbakat. Az adatbázissűrűség és a DNS-szekvencia-terek növekedésével a PCR-alapú rendszerek számára elérhető címek száma még tovább csökken, míg a DORIS nem változik. Ezért a DORIS által biztosított elméleti kapacitás-és sűrűségjavítások nagyságrendekkel nagyobbak lehetnek, mint a szimulációinkban becsült értékek. Továbbá, DORIS nagyban leegyszerűsíti cím tervezés; tervezése sor ortogonális címeket PCR-alapú rendszerek, amelyek nem lépnek kölcsönhatásba adat hasznos szekvenciák gyorsan válik számításigényes nagy adatbázis méretben. Összefoglalva, egy SS-dsDNAs-ból álló adatbázis hatékonyan hozható létre egy pot-reakciókban, az ssDNA-túlnyúlások pedig megkönnyítik a nem PCR-alapú elválasztási módszert, amely fokozza a címspecifitást, és növeli az elméleti adatbázis sűrűségét és kapacitását.

DORIS lehetővé teszi ismételhető fájl hozzáférés

kulcsfontosságú követelmény, de nagy kihívás a mérnöki dinamikus tulajdonságok tárolórendszerek az újrafelhasználhatóság a rendszer. Ebben a munkában inspirációt merítettünk a természetes biológiai rendszerekből, ahol az információ ismételten elérhető a genomikus DNS egyetlen állandó példányából a transzkripció folyamata révén. Amint az ábrán látható. 3a, dinamikus hozzáférési DORIS azzal kezdődik, hogy fizikailag elkülöníteni a fájl a kamat (ss-dsDNAs közös túlnyúlás cím) felhasználásával biotin-linked oligos, valamint streptavidin-alapú, mágneses elválasztás, in vitro átírni (szakmai alapképzés) a DNS RNA31, visszatér a fájl az adatbázis, illetve fordított átírni az RNS a cdns további elemzés, vagy sorozatot.

egy a fájlt nem PCR-alapú mágneses elválasztással különítettek el, miközben az adatbázis helyreállt (megtartott Adatbázis) (n = 3 minden feltételhez). A T7-alapú in vitro transzkripciót közvetlenül a gyöngy-immobilizált fájlon végeztük, legfeljebb 48 órán keresztül, hogy RNS-t generáljunk. Reverz transzkripció átalakított, az RNS, hogy komplementer DNS (cdns), míg a rögzített fájl Egy adták vissza az adatbázisba (Megtartott Fájl) (n = 3 minden feltétel). b Az összeg megmarad adatbázis (fény árnyékolás), valamint a felhalmozott fájl (sötét árnyékolás) után fájl Egy volt elérhető a oligo Egy volt mérve qPCR, illetve ábrázolni százalékában az eredeti összege minden fájlt az adatbázisban. A fájlhozzáférés sajátossága nyilvánvaló, hogy a megőrzött fájlban nincs B és C fájl. A T7 RNS polimeráz (RNAP) jelenléte nem befolyásolta az a fájl megtartását. a C fájlt 5-ször többször is elérik. Az adatbázis a, B és C fájljának mennyiségét qPCR-rel mértük, és minden egyes futtatás után az adatbázisban lévő összes fájl összegeként ábrázoltuk (n = 3 minden feltétel esetén), az egyes fájlok eredeti mennyiségére normalizálva az 1.hozzáférés előtt. Az értékek az aritmetikai átlagot képviselik. A hibasávok S. d., n = A replikált fájl elérésének száma. A forrásadatok Forrásadatfájlként vannak megadva.

Mi végre ez a rendszer három különböző ss-dsDNAs (A, B, C) együttesen képviselő három-fájl, adatbázis, mi pedig elérhető fájl Egy egy biotinylated oligo Egy’ (Fig. 3b & kiegészítő ábra. 4). Ezután a qPCR (EQ) mérte a “megtartott adatbázis” (fény árnyékolás) és a “megtartott fájl” (sötét árnyékolás) mennyiségét és összetételét. (8)). A megőrzött adatbázis magasabb szintű B és C fájlokkal rendelkezett, mint az A, mivel az a fájlok egy részét eltávolították a mágneses elválasztás során. A megtartott fájl tartalmazott többnyire fájl egy szál, minimális B vagy C. A legjobb nettó teljes összeg a fájl visszanyert a megtartott adatbázis megőrzött fájl körülbelül 90% – a volt, amit eredetileg az adatbázisban. Az a fájl magas megőrzési aránya azt javasolta, hogy a fájl többször is elérhető legyen. Ezt úgy teszteltük, hogy ötször többször hozzáfértünk a fájlhoz, és minden egyes hozzáférés után megmértük az A, B és C fájl mennyiségét és összetételét az adatbázisban (ábra). 3c & kiegészítő ábra. 4c). Ahogy az várható volt, a B és C fájl teljes mennyisége viszonylag stabil szinten maradt az adatbázisban. Az a fájl körülbelül 50% – a öt hozzáférés után maradt. A gyakorlati következményei a DNS-tároló rendszerek, hogy csak 2 példányban különböző sorrendben van szükség a kezdeti adatbázis minden 5 alkalommal érhető el (figyelmen kívül hagyva a hatások a strand disztribúció). Ez javulást jelent a PCR – alapú fájlhozzáféréshez képest, ahol az adatbázis kis aliquotjait veszik fel és erősítik. Ebben az esetben minden egyes hozzáféréshez minden egyes különálló sorozat egy példánya szükséges; Továbbá, ellentétben a DORIS, az összes többi adatbázis fájlok hasonlóan csökken bőségesen akkor is, ha nem férnek hozzá. Így a DORIS meghosszabbíthatja a DNS-adatbázisok élettartamát, és gyakoribb hozzáférést biztosít a szintetizált DNS azonos teljes tömegéhez.

ezután megkérdeztük, hogy az IVT-reakció milyen hatással lehet az adatbázis stabilitására, mivel 37 °C-os magas hőmérsékleten történik, és az SS-dsDNS-t lebonthatja. Bár a megőrzött adatbázis nincs kitéve az IVT-nek, a fájl elérhető, és a megőrzött ss-dsDNA mennyiségét befolyásolhatja az IVT hossza. Valójában, míg maga az RNS polimeráz jelenléte nem volt hatással a megtartott fájlra,az IVT idő hossza csökkentette a megtartott fájl mennyiségét (ábra. 3b & kiegészítő ábra. 4a). Érdekes módon a megőrzött fájl 45 °C-on történő újracsomagolása, amely lehetővé teszi, hogy szobahőmérsékletre lehűljön, javította a megőrzési sebességet, de a hosszabb IVT-idők még mindig csökkentették a teljes fájlmegőrzést (kiegészítő ábra. 4b). Ez arra utal, hogy némi veszteség az SS-dsDNA-val versengő gyöngykötésű oligoszokból vagy RNS-ekből való leválasztás miatt következik be, míg némi veszteség a DNS lebomlása miatt következik be. Annak igazolására, hogy az ss-dsDNA nem szennyezte a transzkripált RNS-ből származó cDNS-t, a cDNS-t csak akkor nyerték, ha az RNS polimeráz szerepelt az IVT reakcióban (kiegészítő ábra. 4d).

ezután az IVT minőségének és hatékonyságának értékelésére koncentráltunk. Annak ellenőrzésére, hogy az RNS-polimeráz nem kívánt csonka vagy hosszúkás átiratokat hozhat-e létre, rendeltünk egy hat ssDNAs sorozatot, amelynek hossza 110-180 nt (ábra. 4a & kiegészítő ábra. 5). Ezeket átalakították ss-dsDNS-re, RNS-re átírták, reverz átírták és dsDNA-ra erősítették. Az SS-dsDNA, az RNS és a dsDNA esetében egyértelmű egységes sávok voltak láthatók. Növekvő IVT idő nem növeli a hozamot az RNS minden sablonok (ábra. 4b), bár csak 2 óra elegendő volt ahhoz, hogy tiszta RNS-sávokat kapjunk (ábra. 4c), és az IVT idő nem befolyásolta a keletkezett RNS hosszát. Összefoglalva, az információ az SS-dsDNAs-tól többször is elérhető az oligo-alapú szétválasztással és az IVT-vel.

a hat különböző hosszúságú ssdna oligos-t úgy tervezték, hogy hat SS-dsDNA sablont hozzon létre, amelyek hossza 180 bp, 160 bp, 140 bp, 130 bp, 120 bp és 110 bp. Mindegyik SS-dsDNA egy konszenzusos fordított primer kötési szekvenciát, T7 primer kötési szekvenciát, előre primer kötési szekvenciát, valamint különböző hosszúságú hasznos terhelési szekvenciát tartalmazott. Ezeket az ss-dsDNA sablonokat in vitro 8 órán át átírták, majd RT-PCR követte. A termék méretét agaróz gél elektroforézissel vizsgáltuk. b IVT idő tanfolyam akár 48 h (n = 3 megismételni IVT reakciók minden feltétel). Mind az RNS, mind a DNS sablonmolekulák mennyiségét NanoDrop segítségével mértük, és arányuk szerint ábrázoltuk. C RNS és dsDNS termékek gélelektroforézise 2-48 órás IVT után, majd RT-PCR után. A ábrázolt értékek az aritmetikai átlagot, a hibasávok pedig a három független IVT-reakció S.d. – jét képviselik. A gélképek reprezentatívak az RT-QPCR által mért három független kísérlet esetében. A forrásadatok Forrásadatfájlként vannak megadva.

Átírás lehet által hangolt szervező sorrend

Utolsó működik a molekuláris információt tároló bizonyították, hogy a közüzemi tárolására további információk a keverékek összetétele a különböző molekulák, köztük DNA32,33. Mivel az információ elérhető a DORIS támaszkodik a T7 RNS polimeráz, de nincs bizonyíték arra, hogy T7 szervező változatok hatással lehet átírás efficiency34,35,36,37,38, azt kérdeztük, hogy a hozam T7-alapú átírás lehet modulált által adott nukleotid szekvenciák körül a T7-promoter régió, miközben a szervező maga állandó lehetővé teszi, hogy egy-pot ss-dsDNA generáció (Fig. 2a, b). Hogy átfogóan foglalkozzunk ezzel a kérdéssel, 1088 különálló 160 nt-t terveztünk és rendeltünk meg oligo poolként. Az első 1024 szál tartalmazza az összes lehetséges 5 nt variáns szekvenciát a promoter szekvenciával szemben (Nnnnn-Promoter, N mind a négy nukleotid), az utóbbi 64 szekvencia mind a 3 nt variáns szekvencia volt a promoter után (Promoter-NNN, ábra. 5a). Mivel az NNNNN nukleotidok az ssDNA túlnyúlásánál helyezkedtek el, azt is megkérdeztük, hogy ez a régió egyetlen szálú, szemben a kettős szálúakkal, hatással van-e a relatív transzkripciós hatékonyságra. Először az SS-dsDNA-t hoztuk létre primer kiterjesztéssel, a dsDNA-t pedig az ssDNA oligo pool PCR-jével. Mind az ss-dsDNA, mind a dsDNA adatbázisokat 37 °C-os IVT-vel dolgozták fel 8 órán keresztül, ezt követte az RT-PCR és a következő generációs szekvenálás. Rövid vonalkódokat terveztek a hasznos teher régióban annak meghatározására, hogy melyik promoter változatból származtak az egyes szekvenált átiratok.

a 1088 különálló szekvenciával rendelkező oligo pool SS-dsDNA sablonok létrehozására lett tervezve. Az első 1024 szekvenciák a nukleotidok összes lehetséges kombinációját tartalmazták a promoter szekvencia előtt (nnnn-T7, ahol N A négy DNS-nukleotid egyike), míg az utóbbi 64 szekvenciában a nukleotidok minden lehetséges kombinációja volt a promoter régió felé (T7-NNN). Mindegyik szekvencia vonalkódot tartalmazott a variáns nukleotidok szekvenciájának azonosítására. Az ss-dsDNAs sablont IVT-vel dolgoztuk fel 8 órán keresztül, majd RT-PCR és következő generációs szekvenálás következett (n = 3 minden feltétel esetén). b mindkét szekvencia-terv transzkripciós hatékonyságát úgy ábrázoltuk, hogy az egyes átírt szálak olvasási számát normalizáltuk az eredeti könyvtárban. Az adatokat mindkét terv esetében a legalacsonyabbtól a legmagasabb normalizált bőségig szervezték. c a szekvenciákat további négy kvartilra osztottuk a normalizált átirat bősége alapján, amelyet a WebLogo eszköz elemzett. d az egyes szekvenciák normalizált bőségét a / T százalékkal szervezték. Az egyes csoportok közötti p értékeket egyirányú ANOVA-val, Tukey–Kramer post-hoc-val számítottuk ki, és itt statisztikai szignifikanciára soroltuk. NNNNN-T7: p-érték kisebb, mint 0,01 összehasonlításához 0%-100%, 80%-100% – os, illetve 20%-80%; p értékek kevesebb, mint 0, 001 összehasonlítása 20%-100%, 40%-80%, 40%-100%, 60%-80% 60%-100%; T7-NNN, p érték kisebb, mint 0.05 összehasonlításához 33%-100%, 0%-100% 0% -66%. e az eredeti szintetizált adatbázis (balra) és az átírt adatbázis (jobbra) DNS-szekvencia-pozíciójának százalékos hibája. A hibaarányt úgy számítottuk ki, hogy egy adott típus nukleotidpozícióban előforduló hibáinak számát elosztottuk az adott szekvenciához tartozó leolvasások teljes számával (kiegészítő módszer). A ábrázolt értékek az aritmetikai átlagot, a hibasávok pedig a három független IVT-RT-PCR-NGS minta S.d. értékét képviselik. A forrásadatok Forrásadatfájlként vannak megadva.

az egyes különálló átiratok sorrendjének bősége normalizálódott az eredeti SS-dsDNA bőségére (ábra. 5b) vagy dsDNA (kiegészítő ábra. 6A) adatbázis (EKV. (9)). A normalizált abundanciák széles és szinte folyamatos skáláját kaptuk, jelezve, hogy ezt a megközelítést a jövőben a DNS összetett összetételű keverékeinek létrehozására lehet felhasználni. Annak megállapításához, hogy lehetnek-e egyszerű tervezési elvek, amelyek leírták a promoter hatékonyságát, az 1088 szekvenciákat kvartilokká osztottuk átírás bősége alapján, majd az adatokat importáltuk a WebLogo tool39-be. Megállapítottuk, hogy a G vagy A az 5. pozícióban közvetlenül felfelé, a C vagy T pedig a 3. pozícióban, közvetlenül a T7 promoter után, általában a legmagasabb RNS-abundanciát eredményezte (ábra. 5c). Az adatok A/T-tartalommal történő szegmentálása azt mutatta, hogy a t7 promoter előtt enyhe előnyben részesítették a ~50% A/T-tartalmat, és előnyben részesítették a T7 promoter általános alacsony a/T-tartalmát (ábra). 5d).

Ez a következő generációs szekvenálási kísérlet azt is biztosította, hogy a DORIS méretezhető nagy és összetett SS-dsDNA-medencékre. Továbbá a szekvenálás hibaelemzése nem mutatott szisztematikus törléseket, csonkolásokat vagy szubsztitúciókat, és az Általános hibaszintek jóval alacsonyabbak voltak a DNS-szintézisből már jelen lévőknél (1. ábra). E.5.

DORIS lehetővé teszi a tárolófájl műveletek

sok szervetlen információs tároló rendszerek, még hideg tároló archívumok, fenntartani a képességét, hogy dinamikusan manipulálni fájlokat. A DNS-alapú rendszerek hasonló képességei jelentősen növelnék értéküket és versenyképességüket. az ssDNA túlnyúlásokat korábban a toehold switches40,41,42,43 összefüggésében használták a számítások végrehajtására, ezért feltételeztük, hogy felhasználhatók a tárolófájl-műveletek végrehajtására. Mint a proof-of-elv, mi végre zárolás, felszabadítása, átnevezése, törlése fájlokat, és megmutatta ezeket a műveleteket lehet végezni szobahőmérsékleten (ábra. 6).

a (felső) vázlatos zárolási és feloldási in-storage fájl műveletek. (Alsó) megpróbálja elérni fájl a DORIS reteszelés nélkül (No-Lock), reteszelés nélkül, de kulcs nélkül (NO-Key), vagy reteszelés és kulcs hozzá különböző hőmérsékleten (narancs) (n = 3 minden feltétel). A zárat 98 °C-on adtuk hozzá.a kulcsot különböző hőmérsékleten (narancs) adtuk hozzá, majd 14 °C-ra hűtöttük (n = 3 minden feltétel esetén). Az Oligo A’ – T 25, 35, 45 vagy 75 °C-os különböző hozzáférési hőmérsékleteken adták hozzá 2 percig, majd 1 °c/perc hőmérséklet-csökkenés 25 °C-ra (n = 3 minden feltétel esetén). Az elválasztási hatékonyság az a fájl mennyisége, amelyet a QPCR méri az eredeti mennyiséghez képest. b (felső) sematikus átnevezés és törlés műveletek. Az a fájlt az oligos átnevezésével vagy törlésével módosították. (Alsó) az egyes műveletek befejezését úgy teszteltük, hogy megmérjük, hogy az egyes oligo-k mekkora részét választották el egymástól: A’, B’ vagy C’. Az elválasztási hatékonyság az a fájl mennyisége, amelyet a QPCR méri az adatbázisban szereplő eredeti mennyiséghez képest. Nincs Mod (nincs fájlmódosítás / működés). A ábrázolt értékek az aritmetikai átlagot képviselik, a hibasávok pedig három független replikációs fájlművelet/elválasztás S.d. – jét. A forrásadatok Forrásadatfájlként vannak megadva.

a háromfájlos adatbázissal kezdtük, és teszteltük, hogy egy biotinhoz kötött oligo A’ képes-e 25-75 °C közötti hőmérsékleten megkötni és elválasztani az a fájlt (ábra). 6A, alsó, nincs zár). Az a fájlszálak nagyjából 50% – át sikeresen elválasztották az adatbázistól. A lock fájl Egy, elváltunk fájl Egy a három-fájl, adatbázis, vegyes hosszú 50 nt ssDNA (zár), hogy volt egy 20 nt kiegészítő sorrend a ssDNA túlnyúlás a fájl A. a zár a helyére, oligo Egy’ már nem volt képes, hogy külön a fájlt, kivéve a magasabb hőmérséklet meghaladja a 45 °C, (Fig. 6A, alsó, kulcs nélküli), feltehetően azért, mert a zárat megolvasztották a túlnyúlásból, lehetővé téve az oligo a ” számára, hogy versenyezzen a túlnyúlás megkötésével. A fájl feloldásához hozzáadtuk a kulcsot, amely egy 50 nt ssDNA volt, amely teljesen kiegészíti a zárat. Különböző nyitási hőmérsékleteket teszteltünk, és azt találtuk, hogy a kulcs képes volt eltávolítani a zárat szobahőmérsékleten ugyanolyan hatékonysággal, mint magasabb hőmérsékleten. Ez valószínűleg annak köszönhető, hogy a hosszú 30 nt toehold által bemutatott zár, amely lehetővé teszi a kulcsot, hogy csomagolja ki a zár fájlt A. mi is optimalizált relatív moláris arányok (fájl a: lock: kulcs: oligo A’ = 1: 10: 10: 15) a célon kívüli elválasztás minimalizálása és a megfelelő reteszelés biztosítása. Megfigyeltük, hogy a zár hozzáadásának hőmérséklete befolyásolta a reteszelési folyamat hűségét. 98 °C-on a reteszelési folyamat jól működött. Amikor a zárat 25 °C-on adták hozzá, szivárgó elválasztás történt, még akkor is, ha nem adtak hozzá kulcsot (kiegészítő ábra. 7). Ennek oka az lehet, hogy a másodlagos struktúrák megakadályozzák, hogy néhány fájl a szálak alacsony hőmérsékleten hibridizálódjanak a zárakkal. Szerencsére zár 45 °C volt ésszerű teljesítménye, elkerülve ezzel a kell emelni, hogy a rendszer 98 °C. keretében jövő DNS-tároló rendszer, fájlok első elkülöníthető akkor zárva emelkedett a hőmérséklet, majd visszatért az adatbázis, így elkerülve az expozíció, a teljes adatbázist, hogy a magas hőmérséklet. Az egész folyamat egyébként szobahőmérsékleten is elvégezhető.

a fájl átnevezését és törlését is végrehajtottuk. Az a címmel rendelkező fájl átnevezéséhez B címmel, összekeverjük az a fájlt egy 40 nt ssDNA-val, amely az A-hoz kötődik, a kapott túlnyúlás B cím (ábra. 6b). Az összes komponenst hasonló arányban adtuk hozzá a zárolási folyamathoz (fájl: oligo átnevezése: oligo elérése = 1: 10: 15), az átnevező oligo pedig 45 °C-on került hozzáadásra. Ezután megvizsgáltuk, hogy az egyes oligo a’, B’ vagy C’ fájlszálak hány fájlszálat különíthetnek el, és azt találtuk, hogy az átnevezési folyamat teljesen blokkolta az oligos a’ vagy C ‘ fájlt a fájl elválasztásától (ábra). 6B, alsó). Csak az oligo B ‘ tudta elválasztani a fájlt, ami arra utal, hogy szinte minden szál sikeresen átnevezték A-ból B-be. Az oligos azon képessége alapján, hogy közel 100% – os befejezéssel nevezze át a fájlokat, feltételeztük, sőt azt találtuk, hogy egy rövid 20 nt oligo, amely teljes mértékben kiegészíti az A fájlt, felhasználható az a fájl túlnyúlásának teljes blokkolására, és lényegében törli az adatbázisból (ábra. 6B, alsó). A fájl egyszerűen kivonható egy adatbázisból is, hogy törölje azt is. A blokkoló alapú törlés ezen alternatív formája azonban azt sugallja, hogy az egyik módja annak, hogy a maradék fájlszálakat, amelyeket nem teljesen kibontottak, a jövőben nem szabad dühösen hozzáférni.