DESCRIPTION AND GENERAL NOTES
Restriction endonukleases (REs) ovat bakteerientsyymejä, jotka pilkkovat kaksijuosteista DNA: ta. Tyypin I REs ovat tärkeitä bakteerien toiminnassa, mutta ne eivät halkaise DNA: ta tietyissä sekvensseissä. Tässä käsikirjassa kuvattu tyypin II Riskintasausjärjestelmä vaatii erittäin tarkat DNA-pilkkomispaikat ja on siten erittäin hyödyllinen väline molekyylibiologiassa. Nämä entsyymit mahdollistavat määritettyjen DNA-fragmenttien kloonauksen ja puhdistuksen. Noin 500 tunnettua REs-bakteeria eristetään tyypillisesti erilaisista bakteerikannoista.
REs esiintyy bakteereissa oletettavasti tuhoamaan DNA: ta vieraista lähteistä (esim.tartuttamalla bakteriofagi) pilkkomalla vieras DNA: n tiettyihin tunnistuskohtiin. Isäntäbakteerin DNA: ta suojataan pilkkoutumiselta, koska sen tunnistuskohtaa muutetaan yleensä metyloimalla jokin alueen emäs, jolloin se ei enää ole substraatti uudelleen pilkkoutumiselle. Käytännössä eri bakteerikannoista on puhdistettu REs, jolla on erilaiset tunnistuspaikan ominaispiirteet, ja molekyylibiologit käyttävät niitä määritellyissä olosuhteissa hajottaakseen eukaryoottisista lähteistä peräisin olevan puhdistetun DNA: n määritellyiksi fragmenteiksi in vitro-reaktiossa. Laboratoriossa kloonatun DNA: n levittämiseen käytetyt isäntäbakteerit ovat yleensä mutantteja isäntärajoitusgeeneissä (hsdR, hsdM tai hsdS), joten niiden solunsisäiset entsyymitoiminnot eivät tuhoa vieraita rekombinanttisekvenssejä.
monien uusiutuvien energialähteiden pilkkoutumiskohdan ominaispiirteet on määritelty. Esimerkiksi RE EcoRI edellyttää, että kuusi emäsparia esiintyy seuraavassa erityisjärjestyksessä:
EcoRI tunnistaa tämän sekvenssin ja halkaisee sen ainutlaatuisella tavalla, jolloin muodostuu kaksi terminiä, joissa on ulkonevat 5′ päät:
nämä päät ovat toisiaan täydentäviä (”sticky”) ja voidaan liittää entsymaattisesti muihin EcoRI-generoituihin termiineihin T4-DNA-ligaasin avulla. Muut Riskintasausjärjestelmät tunnistavat eri sekvenssejä ja tekevät ainutlaatuisia halkeamia, jotka johtavat muihin määriteltyihin termiineihin, joista joissakin on myös 5′ ulkonevaa päätä, 3′ ulkonevaa päätä tai ei lainkaan ulkonevia (tylppiä) päitä (KS.taulukko 5.1). Jokaisella RE: llä on tietty sekvenssi ja määrä nukleotideja, joita tarvitaan tunnistuskohdan luomiseen. Osa uusiutuvista lähteistä ei vaadi tiettyä nukleotidia tunnistuskohdan jokaiseen asentoon. Joissakin tapauksissa esimerkiksi puriininukleotidi (A tai G) tietyssä asennossa riittää. Frekvenssi, jolla RE leikkaa DNA: ta, on siis suhteessa emästen lukumäärään tunnistussekvensseissä (jos tarvitaan enemmän emäksiä, tehdään vähemmän leikkauksia) ja spesifisiin emästen lukumäärään missä tahansa asennossa.
REs-arvot ovat hyödyllisiä, koska niiden spesifisyys ja tuloksena oleva ligatable termini mahdollistavat DNA: n dissektion, analyysin ja uudelleenjärjestelyn hallitusti, ennustettavasti, paikkasidonnaisesti. Koska ne ovat entsyymejä, jokaisella on erityisiä vaatimuksia olosuhteisiin, jotka johtavat optimaaliseen pilkkoutumiseen. Onneksi monet ovat aktiivisia samanlaisissa olosuhteissa, ja ensisijainen muuttuja on ionivahvuus (eli NaCl puskurissa). Käytännön ehdot on määritelty empiirisesti kunkin RE: n käyttämiseksi tutkimusvälineenä.
RE-aktiivisuuden määrää ei yleensä määritellä klassisen entsyymikinetiikan avulla. Sen sijaan RE activity määritellään käytännössä käytettäväksi laboratoriossa. Yksi RE: n aktiivisuusyksikkö (U) määritellään yleensä entsyymimääräksi, joka leikkaa DNA-näytteessä (yleensä bakteriofagi λ) 1 µg: n kaikissa tietyissä kohdissa 1 tunnissa 37°C: ssa. Saavutettu todellinen aktiivisuus voi olla erilainen, jos esiintyy muita RE digestiokohtia. Jos esimerkiksi 1 U re: stä riittää leikkaamaan 1 µg bakteriofagia λ DNA: ta kokonaan yhdestä kohdasta standardimääritysolosuhteissa, se ei välttämättä pysty leikkaamaan kokonaan 1 µg: ta DNA-näytteestä, jossa on neljä kohtaa RE: tä varten, tai näytteestä, jota ei ole puhdistettu riittävästi.
myös muut reaktio-olosuhteisiin liittyvät tekijät vaikuttavat RE-aktiivisuuteen. Näitä ovat DNA: n puhtaus, puskuri, lämpötilaolosuhteet ja itse RE. DNA: n metylaatio, sitoutunut proteiini tai molekyylipainoltaan suuren DNA: n liiallinen viskositeetti viskoosisissa liuoksissa voi heikentää uudelleenpalautuksen tehokkuutta. Leikattavassa DNA: ssa ei yleensä ole epäpuhtauksia; SS-fenoli/kloroformi-uutto ja etanolin saostus (kohta 20-1) poistavat monia häiritseviä epäpuhtauksia. Sen sijaan RNA tai yksijuosteinen DNA eivät yleensä vaikuta haitallisesti valtaosaan uusiutuvista lähteistä. Näin ollen tRNA: n lisääminen kopresipitantiksi voi olla hyödyllistä pienten DNA-määrien talteenotossa vaikuttamatta myöhempiin uudelleenkalastuksiin.
RE-reaktion tyypillisessä määritystilassa on puskuri (10 mM Tris, pH 7.4 on yleinen), 10 mM Mg2+, eikä siinä ole merkittäviä kelatoivien aineiden pitoisuuksia (TE-puskuri sisältää riittävän pienen määrän EDTA: ta). RE puskureissa on myös oikea suolapitoisuus, joka antaa optimaalisen ionilujuuden kullekin RE: lle. Joissakin tapauksissa lisätään BSA: ta, DTT: tä ja spermidiiniä optimaalisen entsyymiaktiivisuuden aikaansaamiseksi. Neljä yleistettyä RE-puskuria voi täyttää useimpien uusiutuvien energialähteiden vaatimukset, ja näiden puskimien 10 × varastojen ennakkovalmistelua kuvataan jäljempänä. Suurin osa uudelleenkiillotuksista tehdään 37°C: n lämpötilassa, joskin muutamia poikkeuksia on, kuten TaqI.
useimpiin ostettuihin Riskintasausjärjestelmiin toimitetaan sopiva varastointipuskuri, mutta se sisältää 25-50% glyserolia, joka estää jäätymisen varastoinnin aikana -20°C: ssa. yli 5%: n (vol / vol) glyserolipitoisuudet re-digestiomäärityksissä voivat estää monien Riskintasausmenetelmien toimintaa.lisäksi suuret glyserolipitoisuudet re-digestion aikana voivat heikentää joidenkin Riskintasausjärjestelmien sekvenssispesifisyyttä, mikä johtaa vääriin pilkkoutumisiin. Ilmiö näkyy esimerkiksi yleisesti käytetyllä RE EcoRI-ilmiöllä, jossa joissain olosuhteissa havaittua harhaliikettä kutsutaan EcoRI* (tähti) – aktiivisuudeksi. Näistä syistä on tärkeää, että Re-digestioreaktion tilavuus on niin suuri, että se käsittää vähintään 1:10 laimennoksen itse RE: stä (ja siten vähentää glyserolipitoisuutta). Muut tekijät, kuten pH, etanoli, tai virheellinen suolapitoisuus voi myös aiheuttaa tähden aktiivisuutta tai vähentynyt aktiivisuus; näin ollen huolellinen noudattaminen suositelluissa olosuhteissa on tärkeää.
muutama muu seikka on hyödyllinen käytettäessä REs: ää. käytä uutta pipetin kärkeä aina, kun RE: ää siirretään. Jäämiä kontaminantti lisätään RE varastossa voi estää sen jatkokäytön ja sekoittaa tulokset myöhemmissä kokeissa. Optimoitaessa reaktioita, on parempi lisätä ylimääräisiä RE kuin inkuboida paljon kauemmin kuin 1 h. lisäksi, kuten edellä mainittiin, entsyymiaktiivisuus on määritelty vain leikkaus DNA standardi. Koska näyte on yleensä aivan erilainen kuin standardi, hyvä opas on käyttää noin 2-3 U RE per mikrogrammaa DNA leikataan, varsinkin kun yritetään sulattaa vaikea näyte. Joskus voi olla tarpeen titrata määrä RE tarvitaan sulattamaan DNA-näyte asianmukaisesti.
lopuksi on kiinnitettävä huomiota molempien optimaalisiin suolaolosuhteisiin. Jos molemmat vaativat saman puskurin, ruoansulatus voidaan tehdä joko samanaikaisesti tai peräkkäin. Jos tarvitaan erilaisia suolaolosuhteita, on käytettävä ensin vähemmän suolaa vaativaa. Inkubaation jälkeen säädä suolatilaa ja sulata RE vaatii runsaasti suolaa. RE aktiivisuus voidaan poistaa SS-fenoli/kloroformi uuttamalla kaikissa tapauksissa. Osa uusiutuvista energialähteistä on termolabiileja, ja ne voidaan inaktivoida kuumentamalla 70°C: seen 5 minuutin ajan. Tämä ominaisuus, kuitenkin, vaihtelee RE seuraavaan ja olisi tarkistettava kunkin RE käytetään.