Rotación impulsada por hidrólisis de ATP
El ciclo rotativo hidrolítico se compone de tres pasos de 120o en el dominio catalítico F1 de la enzima, definido en experimentos biofísicos de rotación por «moradas catalíticas» . Cada paso de 120o se divide en sub-pasos definidos por una permanencia catalítica después de cada paso de 120o, con una permanencia intermedia de «unión a ATP» a 30o y una permanencia de «liberación de fosfato» a 95o. La liberación de fosfato permite a la enzima completar el paso de 120o y llegar a la permanencia de unión de ATP. Hemos descrito las estructuras del dominio catalítico F1 en la liberación de fosfato y las moradas catalíticas, y hemos demostrado que el sub-paso giratorio de 35o entre la liberación de fosfato y las moradas catalíticas depende de la liberación de fosfato de la morada de «unión a ATP», que luego permite que la enzima proceda a la «morada catalítica» . El propio dwell catalítico representa una transición en la que una molécula de ATP unida se prepara para la hidrólisis. Nuestros esfuerzos actuales se centran en definir la presencia catalítica en la encefalopatía F1-ATPasa.
La película de la Generación de 30º de rotación de la γ-subunidad en la encefalopatía F1-Atpasa por la liberación de fosfato de la ßE de la subunidad. La película comienza con una vista desde el lado de F1-Tiop en representación de cinta, con el tiofosfato encuadernado como esferas de color naranja. Las subunidades α y β son rojas y amarillas, respectivamente. Luego, las subunidades aTP, aDP, ßTP y ßDP se eliminan secuencialmente dejando el dímero aEßE y las subunidades de tallo central γ, δ y ε (azul, magenta y verde, respectivamente). Esta residual subcomplejo se gira a la derecha alrededor del eje 100° exponer una vista lateral de la aE-subunidad y el tallo central. Luego, se eliminan las subunidades δ y ε y los residuos γ-42 – 210, y la subunidad ERS se vuelve más débil. En los marcos finales, el fosfato unido se libera y la subunidad aE se abre y se aleja de la subunidad γ, interrumpiendo las interacciones de empaquetamiento entre las subunidades AE y γ. Para restablecer estas interacciones, la subunidad γ gira 30°. La estructura del estado final es el estado post-liberación de fosfato de la F1-ATPasa bovina que se encuentra en la F1-I3-Tiop.
Rotación impulsada por pmf
El dato clave que falta para comprender la generación de rotación a partir de la pmf es la estructura detallada a nivel atómico de la ruta que los protones toman a través del dominio de membrana de la enzima. La mejor estructura disponible hasta la fecha es la que determinamos con una resolución de 4 Å en 2015 mediante cristalografía de rayos X del complejo enzimático de Paracoccus denitrificans . Otros se determinaron en 2015 y 2016 mediante microscopía crioelectrónica de partículas individuales de enzimas bovinas y fúngicas, en el mejor de los casos a una resolución de 6 Å . Sin embargo, todos estos modelos carecen del detalle requerido para la formulación de un mecanismo molecular de generación de rotación a partir de la fuerza motriz del protón, y, debido a la motilidad y flexibilidad de las enzimas, las partículas individuales de la enzima pueden adoptar muchas posiciones diferentes. Por lo tanto, presenta un problema inusualmente difícil para el enfoque cryo-em.
Figura el dominio de membrana de la F-ATPasa de P. angusta. En A-D, la subunidad a es azul flor de maíz. A y B, vistas en representación sólida desde el lado, y debajo del dominio de membrana. El anillo c10 es gris, la subunidad b (parte superior no mostrada) es rosa, y los segmentos amarillo pálido, rojo ladrillo, cian claro y beige son hélices α transmembrana, Ch1-Ch4 asignadas a la subunidad f, ATP8, aH1 y bH1, respectivamente. En el anillo C, I-IV indican las cuatro hélices α terminales C transmembrana en contacto con la subunidad a. C y D, vistas de la subunidad a en representación sólida y de dibujos animados vistas desde el exterior y mirando desde la interfaz con el anillo C, respectivamente, con aH1 en cian pálido. Los residuos polares conservados son amarillos, las posiciones de mutaciones humanas asociadas a patologías (ver Tabla S1) son rojas. La esfera rosada denota el Arg-179 conservado en aH5 que es esencial para la translocación de protones. La flecha inferior indica la vía de entrada de protones que se transfieren a Glu-59 en la hélice α-II del terminal C del anillo c. Son transportados alrededor del anillo por rotación en sentido contrario a las agujas del reloj, como se ve desde arriba, hasta que llegan a Arg-179, donde entran en el camino de salida, indicado por la flecha superior.
Estructuras de ATP sintasas bacterianas
Figura ATP sintasas bacterianas. A) F1-ATPasa de Caldalkalibacillus thermarum a una resolución de 2,6 Å por cristalografía de rayos X; B) Enzima ATP sintasa de Paracoccus denitrificans a una resolución de 4 Å por cristalografía de rayos X; C) ATP sintasa de Escherichia coli a una resolución de 7 Å por crio-EM.
En relación con los extensos estudios que hemos realizado sobre enzimas mitocondriales, las estructuras de las ATP sintasas bacterianas han sido poco investigadas, excepto las estructuras de los dominios catalíticos F1 de las enzimas de Escherichia coli y Geobacillus stearothermophilus (anteriormente Bacillus stearothermophilus) a una resolución de 3,2 y 3,9 Å, respectivamente, y las estructuras de los anillos c de sus dominios de membrana de varias especies . Para llenar esta laguna, hasta ahora hemos contribuido con la estructura de toda la enzima de Paracoccus denitrificans a una resolución de 4 Å , y, en colaboración con el profesor G. M. Cook y sus colegas en Dunedin, Nueva Zelanda, las estructuras de los dominios catalíticos F1 de las ATP sintasas de Caldalkalibacillus thermarum, Fusobacterium nucleatum y Mycobacterium smegmatis. C. thermarum es un termoalcalífilo, y la estructura de su dominio catalítico a una resolución de 2,6 Å es la estructura más precisa de una F1-ATPasa bacteriana hasta ahora determinada . La enzima de M. smegmatis está estrechamente relacionado con la enzima de M. tuberculosis. La estructura de su dominio catalítico se ha determinado con una resolución de 4 Å y proporciona un objetivo para el desarrollo de nuevos fármacos antituberculosos . El patógeno periodontal oportunista, Fusobacterium nucleatum, está asociado con una amplia gama de enfermedades que incluyen infecciones orales, resultados anticipados del embarazo, enfermedades gastrointestinales y aterosclerosis. Además, se ha relacionado con el desarrollo y la progresión del cáncer colorrectal a través de la inhibición de las vías de señalización inmunitarias antitumorales y la posterior promoción de la quimiorresistencia. Es un anaeróbico obligado y acopla la energía libre de descarboxilación de glutaconil-CoA a crotonil-CoA para el transporte de iones Na+ a través de su membrana celular para generar una fuerza motriz de iones de sodio (smf). La ATP sintasa utiliza el smf para impulsar la síntesis de ATP necesaria para las reacciones catabólicas y anabólicas. La estructura de su dominio catalítico F1 se ha determinado a una resolución de 3,6 Å . Usando crio-EM, se ha publicado un mapa de la ATP sintasa intacta de E. coli que muestra la subunidad ε en la posición «arriba» (ver más abajo) , y recientemente, se ha determinado que una estructura de la ATP sintasa de Geobacillus stearothermophilus es de 3 Å .
Estructura de las ATP sintasas del parásito
Figura la F1-ATPasa de Trypanosoma brucei. Las subunidades α-, β-, γ-, δ-, ε-y p18 son rojas, amarillas, azules, verdes, magenta y cian respectivamente. (A y B) Representaciones de dibujos animados de las vistas laterales y superiores; (C-E) representaciones superficiales de (C), la ATPasa F1 bovina, (D), la T. enzima brucei en gris con p18 eliminado y las secciones coloreadas que muestran los aminoácidos adicionales a la enzima bovina, y (E), la enzima T. brucei con p18 presente.
Las estructuras y funciones de los componentes de las ATP sintasas, especialmente aquellas subunidades involucradas directamente en la formación catalítica de ATP, se conservan ampliamente en metazoos, hongos, eubacterias y cloroplastos de plantas. Sobre la base de un mapa en 32.Resolución de 5 Å determinada in situ en las mitocondrias del parásito euglenozoario, Trypanosoma brucei, por crio-tomografía de electrones, se ha propuesto que la ATP sintasa en esta especie tiene una estructura no canónica con diferentes sitios catalíticos, donde el dedo de arginina catalíticamente esencial es proporcionado, no por la subunidad α adyacente al sitio de unión de nucleótidos catalíticos, como en todas las especies investigadas hasta la fecha, sino por una proteína llamada p18 que se encuentra solo en los euglenozoos . En colaboración con los doctores Alena Zíková y Ondřej Gahura del Instituto de Parasitología de České Budějovice en la República Checa, hemos caracterizado la F1-ATPasa de T. brucei y determinado una estructura cristalina de la enzima a una resolución de 3,2 Å . Esta estructura muestra que la propuesta de que el dominio catalítico de esta ATP sintasa tiene una estructura no canónica y diferentes sitios catalíticos es incorrecta. En muchos aspectos, la estructura de la ATPasa F1 de T. brucei es muy similar a la de las ATPasas F1 determinadas previamente. La porción esférica α3β3 del dominio catalítico, donde se encuentran los tres sitios catalíticos, más el tallo central, están altamente conservados, y el dedo de arginina es proporcionado convencionalmente por las subunidades α adyacentes a cada uno de los tres sitios catalíticos encontrados en las subunidades β. Por lo tanto, la enzima tiene un mecanismo catalítico convencional. La estructura difiere de las anteriores por tener una subunidad p18, identificada solo en los euglenozoos, asociada con la superficie externa de cada una de las tres subunidades α, elaborando así el dominio F1. La subunidad p18 es una proteína de repetición de pentatricopéptido (PPR) con tres PPRs y parece no tener ninguna función en el mecanismo catalítico de la enzima. T. brucei es el agente causal de la enfermedad del sueño en humanos y enfermedades relacionadas en animales domésticos que viven en el África subsahariana, y la estructura de sus ATPasas F1 proporciona un objetivo para el desarrollo de nuevos medicamentos para tratar la enfermedad.
El papel de la cardiolipina
La cardiolipina lipídica aniónica es un componente esencial de las ATP sintasas activas. En los metazoos, sus rotores contienen un anillo de ocho subunidades c que consisten en círculos internos y externos de hélices α terminales N y C, respectivamente. El comienzo de la hélice α-terminal C contiene un residuo de lisina estrictamente conservado y totalmente trimetilado en la región del grupo cabeza lipídica de la membrana. Anillos más grandes de estructura conocida, de c9-c15 en eubacterias y cloroplastos, conservan un residuo de lisina o arginina en la posición equivalente. En simulaciones por computadora de membranas hidratadas que contenían anillos c8 bovinos trimetilados o no, y anillos c10 o c11 bacterianos, los grupos de cabeza de las moléculas de cardiolipina se asociaron selectivamente con estos residuos de lisina modificados y no modificados y con aminoácidos polares adyacentes, y con una segunda lisina conservada en el lado opuesto de la membrana, mientras que los lípidos fosfatidil se atrajeron poco a estos sitios .
la Figura Modos de unión de cardiolipina para trimetilada c8-anillos. Las hélices α terminales N y C de las subunidades c son de color gris oscuro y gris claro, respectivamente. Las moléculas de cardiolipina son verdes, con grupos de fosfato rosados. Las grandes esferas de colores representan las perlas de grano grueso para aminoácidos específicos, como se indica, situadas a 0,7 nm de las perlas de fosfato de cardiolipina. Partes A y B, la región del grupo cabeza de la cardiolipina en la valva interna de la membrana unida, respectivamente, a dos subunidades c adyacentes (subunidades 8 y 1), y a una única subunidad c; parte C, una molécula de cardiolipina en la valva externa de la membrana unida a una única subunidad c.
Sin embargo, los tiempos de residencia de las moléculas de cardiolipina con el anillo fueron breves y suficientes para que el rotor girara solo una fracción de grado en la enzima activa. Con el anillo c8 desmetilado y con los anillos c10 y c11, la densidad de las moléculas de cardiolipina unidas en este sitio aumentó, pero los tiempos de residencia no cambiaron mucho. Estas interacciones muy específicas pero breves con el anillo c giratorio son consistentes con las funciones de la cardiolipina en la estabilización y lubricación del rotor y, al interactuar con la enzima en la entrada y salida del canal de protones transmembrana, en la participación en la translocación de protones a través del dominio de membrana de la enzima.
Simulación de la interacción de cardiolipina con el nativo de la especie bovina c8-ring. La columna vertebral de la proteína se muestra en gris claro, con cadenas laterales de Lys – 43 (rojo), Gln-44 (amarillo), Gln-45 (azul) y Ser-48 (cian) como esferas. Las moléculas de cardiolipina se muestran como barras verdes, con fosfatos como esferas rosadas; las moléculas POPC y POPE se muestran como barras de color gris oscuro con fosfatos como esferas de color gris oscuro.