Durante sus años de trabajo como médico Michaelis y un amigo (Peter Rona) construyeron un laboratorio compacto, en el hospital, y en el transcurso de cinco años, Michaelis se publicó con éxito más de 100 veces. Durante su investigación en el hospital, fue el primero en ver los diferentes tipos de inhibición; específicamente usando fructosa y glucosa como inhibidores de la actividad de la maltasa. La maltasa divide la maltosa en dos unidades de glucosa o fructosa. Los resultados de ese experimento permitieron la divergencia entre la inhibición no competitiva y la inhibición competitiva. La inhibición no competitiva afecta el valor de kcat (pero no el Km) en cualquier gráfico dado; este inhibidor se une a un sitio que tiene especificidad para la molécula determinada. Michaelis determinó que cuando el inhibidor se une, la enzima se inactiva.

Al igual que muchos otros científicos de su tiempo, Leonor Michaelis y Maud Menten trabajaron en una reacción que se utilizó para cambiar la conformación de la sacarosa y convertirla en dos productos: fructosa y glucosa. La enzima involucrada en esta reacción se llama invertasa, y es la enzima cuya cinética ha sido apoyada por Michaelis y Menten para ser revolucionaria para la cinética de otras enzimas. Al expresar la velocidad de la reacción estudiada, derivaron una ecuación que describe la velocidad de una manera que sugiere que depende principalmente de la concentración de enzimas, así como de la presencia del sustrato, pero solo hasta cierto punto.

Adrian Brown y Victor Henri sentaron las bases para los descubrimientos en cinética enzimática por los que Michaelis y Menten son conocidos. Brown imaginó teóricamente el mecanismo que ahora se acepta para la cinética enzimática, pero no tenía los datos cuantitativos para hacer una afirmación. Victor Henri hizo contribuciones significativas a la cinética enzimática durante su tesis doctoral, sin embargo, no señaló la importancia de la concentración de iones de hidrógeno y la mutarotación de la glucosa. El objetivo de la tesis de Henri era comparar su conocimiento de las reacciones catalizadas por enzimas con las leyes reconocidas de la química física. A Henri se le atribuye ser el primero en escribir la ecuación que ahora se conoce como la ecuación de Michaelis-Menten. Utilizando glucosa y fructosa en las reacciones catalíticas controladas por maltasa e invertasa, Leonor Michaelis fue el primer científico en distinguir los diferentes tipos de inhibición mediante el uso de la escala de pH que no existía en la época de Henri.

Particularmente durante su trabajo en describir la velocidad de esta reacción, también probaron y extrapolaron la idea de otro científico, Victor Henri, de que la enzima que estaban usando tenía cierta afinidad por ambos productos de esta reacción: fructosa y glucosa. Usando los métodos de Henri, Michaelis y Menten casi perfeccionaron este concepto de método de tasa inicial para experimentos en estado estacionario. Estaban estudiando la inhibición cuando descubrieron que la inhibición no competitiva (mixta) se caracteriza por su efecto en kcat (tasa de catalizador), mientras que la competitiva se caracteriza por su efecto en la velocidad (V). En los experimentos de Michaelis y Menten se centraron en gran medida en los efectos de pH de la invertasa utilizando iones de hidrógeno. La invertasa es una enzima que se encuentra en levaduras extracelulares y reacciones catalizadas por hidrólisis o inversión de una sacarosa (mezcla de sacarosa y fructosa) en «azúcar invertido».»La razón principal para usar la invertasa era que se podía ensayar fácilmente y los experimentos se podían hacer de manera más rápida. La sacarosa gira en polarímetro como dextroratadora-D, mientras que el azúcar invertido es levorotatoria-L. Esto hizo que el seguimiento de la inversión del azúcar sea relativamente simple. También encontraron que la α-D-glucosa se libera en reacciones catalizadas por la invertasa, que es muy inestable y cambia espontáneamente a β-D-glucosa. Aunque ambos están en la forma dextroratatoria, aquí es donde notaron que la glucosa puede cambiar espontáneamente, también conocida como mutarotación. No tomar esto en consideración fue una de las principales razones por las que los experimentos de Henri se quedaron cortos. Usando invertasa para catalizar la inversión de sacarosa, pudieron ver qué tan rápido reaccionaba la enzima por polarimetría; por lo tanto, se encontró que la inhibición no competitiva ocurría en la reacción donde la sacarosa se invertía con invertasa.