DESCRIPCIÓN Y NOTAS GENERALES

Las endonucleasas de restricción (REs) son enzimas bacterianas que escinden ADN de doble cadena. Las RES de tipo I son importantes en la función bacteriana, pero no rompen el ADN en secuencias específicas. Las RES de tipo II, descritas para su uso en este manual, requieren sitios altamente específicos para la escisión del ADN y, por lo tanto, son herramientas extremadamente útiles en biología molecular. Estas enzimas permiten la clonación y purificación de fragmentos de ADN definidos. Las aproximadamente 500 RES conocidas generalmente se aíslan de una variedad de cepas bacterianas.

Las RES están presentes en bacterias presumiblemente para destruir el ADN de fuentes extrañas (por ejemplo, infectando bacteriófagos) al escindir el ADN extraño en sitios de reconocimiento específicos. El ADN de la bacteria huésped está protegido de la escisión porque los sitios de reconocimiento específicos se modifican, generalmente por metilación en una de las bases del sitio, haciendo que el sitio ya no sea un sustrato para la RE escisión. En la práctica, las RES con diferentes especificidades del sitio de reconocimiento se han purificado de varias cepas bacterianas y son utilizadas por biólogos moleculares en condiciones definidas para escindir el ADN purificado de fuentes eucariotas en fragmentos definidos en una reacción in vitro. Las bacterias del huésped utilizadas para propagar el ADN clonado en el laboratorio generalmente son mutantes en los genes de restricción del huésped (hsdR, hsdM o hsdS); por lo tanto, sus actividades enzimáticas intracelulares no destruirán las secuencias recombinantes extrañas.

Estos extremos son complementarios («pegajoso») y puede ser enzimáticamente a adjuntar a cualquier otro EcoRI-generado de termini, el uso de T4 ADN ligasa. Otros RES reconocen diferentes secuencias y hacen hendiduras únicas que dan como resultado otros termini definidos, algunos de los cuales también tienen extremos sobresalientes de 5′, extremos sobresalientes de 3′ o extremos no sobresalientes (romos) (ver Tabla 5.1). Cada RE tiene una secuencia específica y un número de nucleótidos necesarios para crear el sitio de reconocimiento. Algunas RES no requieren un nucleótido específico en cada posición del sitio de reconocimiento. Por ejemplo, en algunos casos un nucleótido de purina (A o G) en una posición definida es suficiente. La frecuencia con la que un RE cortará el ADN está relacionada con el número de bases en las secuencias de reconocimiento (si se requieren más bases, se pueden hacer menos cortes) y las bases específicas en cualquier posición.

Las RES son útiles porque su especificidad y los terminales ligables resultantes permiten la disección, el análisis y la reestructuración del ADN de una manera controlada, predecible y específica del sitio. Debido a que son enzimas, cada una tiene requisitos específicos para condiciones que conducen a una actividad óptima de escisión. Afortunadamente, muchos están activos en condiciones similares, con la variable principal siendo la fuerza iónica (es decir, NaCl en el búfer). Se han definido empíricamente las condiciones prácticas para utilizar cada RE como herramienta de investigación.

La cantidad de actividad RE generalmente no se define utilizando la cinética enzimática clásica. Más bien, la actividad de energía renovable se define en términos prácticos para su uso en el laboratorio. Una unidad (U) de actividad para una RE se define generalmente como la cantidad de enzima que cortará 1 µg en todos los sitios específicos de una muestra de ADN (generalmente bacteriófago λ) en 1 hora a 37°C. La actividad real alcanzada puede ser diferente si hay sitios adicionales de RE digestión presentes. Por ejemplo, si 1 U de una RE es suficiente para cortar 1 µg de ADN del bacteriófago λ completamente en un sitio en condiciones de ensayo estándar, es posible que no pueda cortar completamente 1 µg de una muestra de ADN que tenga cuatro sitios para una RE, o una muestra que no haya sido suficientemente purificada.

Otros factores relacionados con las condiciones de reacción también afectan a la actividad RE. Estos incluyen la pureza del ADN, el tampón, las condiciones de temperatura y el RE en sí. La metilación del ADN, la proteína unida o la viscosidad excesiva del ADN de alto peso molecular en soluciones viscosas pueden disminuir la eficiencia de un RE digest. El ADN a cortar generalmente debe estar libre de impurezas; la extracción de SS-fenol/cloroformo y la precipitación de etanol (Sección 20-1) eliminarán muchas impurezas interferentes. Por el contrario, la mayoría de las RES no suelen verse afectadas negativamente por el ARN o el ADN monocatenario. Por lo tanto, la adición de ARNt como coprecipitante puede ser útil en la recuperación de pequeñas cantidades de ADN sin afectar las digestiones posteriores.

La condición típica de ensayo para una reacción RE contiene un tampón (10 mm Tris, pH 7,4 es común), 10 mm Mg2+, y está libre de concentraciones sustanciales de agentes quelantes (el tampón TE contiene una cantidad suficientemente baja de EDTA). Los amortiguadores de RE también contienen concentraciones de sal adecuadas para dar la fuerza iónica óptima para cada RE. En algunos casos, se agregan ASC, TDT y espermidina para proporcionar una actividad enzimática óptima. Cuatro amortiguadores de RE generalizados pueden satisfacer los requisitos de la mayoría de los amortiguadores de RE, y la preparación anticipada de existencias de 10 × de estos amortiguadores se describe a continuación. La mayoría de las RE digestiones se realizan a 37 ° C, aunque hay algunas excepciones, como el TaqI.

La mayoría de las RES compradas se envían con un tampón de almacenamiento apropiado, pero este contiene un 25-50% de glicerol para evitar la congelación durante el almacenamiento a -20 ° C. Concentraciones de glicerol de más del 5% (vol/vol) en los ensayos de digestión de RE pueden inhibir la actividad de muchas RES. Además, las altas concentraciones de glicerol durante la digestión de RE pueden relajar la especificidad de secuencia de algunas RES, lo que resulta en escisiones espurias. Por ejemplo, este fenómeno se observa con el RE EcoRI de uso común, donde la actividad espuria observada en algunas condiciones se denomina actividad EcoRI* (estrella). Por estas razones, es importante hacer que el volumen de la reacción de digestión de RE sea lo suficientemente grande como para abarcar al menos una dilución de 1:10 de la propia RE (y así reducir la concentración de glicerol). Otros factores, como el pH, el etanol o una concentración inadecuada de sal, también pueden causar actividad estelar o disminución de la actividad; por lo tanto, es importante seguir cuidadosamente las condiciones recomendadas.

Algunas otras consideraciones son útiles al usar REs. Use una punta de pipeta nueva cada vez que se transfiera una RE. Las trazas de contaminantes que se agregan a la reserva de energía renovable pueden impedir su uso posterior y confundir los resultados obtenidos en experimentos posteriores. Al optimizar las reacciones, es mejor agregar RE adicional que incubar durante mucho más de 1 hora. Además, como se mencionó anteriormente, la actividad enzimática se define solo para cortar un patrón de ADN. Debido a que su muestra generalmente es bastante diferente de la estándar, una buena guía es usar aproximadamente 2-3 U de RE por microgramo de ADN para cortar, especialmente cuando se intenta digerir una muestra difícil. A veces puede ser necesario valorar la cantidad de RE necesaria para digerir una muestra de ADN de manera adecuada.

Finalmente, si se van a utilizar dos RES, se debe prestar atención a las condiciones óptimas de sal de cada una. Si ambos requieren el mismo tampón, la digestión se puede hacer de forma simultánea o secuencial. Si se requieren diferentes condiciones de sal, primero se debe usar la RE que requiere menos sal. Después de la incubación, ajuste la condición de sal y digiera con el RE que requiere un alto contenido de sal. La actividad de RE se puede eliminar mediante extracción de SS-fenol / cloroformo en todos los casos. Algunos RES son termolábiles y se pueden inactivar calentando a 70°C durante 5 min. Esta propiedad, sin embargo, varía de una RE a la siguiente y debe verificarse para cada RE utilizada.