Después de la introducción de una cepa particularmente neuroinvasiva y virulenta del virus del Nilo Occidental (VNO) en el noreste de los Estados Unidos, hubo un brote dramático de infecciones mortales en aves, acompañado de un número mucho menor pero alarmante de infecciones mortales en caballos y seres humanos.1,16,17,20,22 En 3 años, el recién introducido virus Flavio se había extendido por todo el continente norteamericano, dejando a su paso incontables miles de aves muertas y miles de casos confirmados de enfermedad, incluidos cientos de muertes en caballos y seres humanos. Los informes de morbilidad y mortalidad en otros animales domésticos han sido menos numerosos. Los casos de aves y equinos alcanzaron su punto máximo en Mississippi durante 2002.

A principios de noviembre de 2002, un Terrier Maltés esterilizado de 2 años de edad se presentó al veterinario de referencia con un inicio agudo de rodadura episódica e incontrolada, que progresó rápidamente a temblores en todo el cuerpo y ataxia. El tratamiento inicial con fenobarbital oral y un ciclo corto de prednisona produjo una mejoría mínima. Después de 1 semana, el caso fue remitido al Centro de Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Estatal de Mississippi, MS. El examen neurológico mostró signos de corea que consistían en movimientos accidentales involuntarios, irregulares y espasmódicos que afectaban a todo el cuerpo. Los globos oculares también mostraron movimientos erráticos similares. La propiocepción consciente y las reacciones de salto también disminuyeron ligeramente en las extremidades delanteras. Las enfermedades que causan movimientos adventicios involuntarios generalmente afectan áreas de la corteza cerebral, o núcleos extrapiramidales específicos del telencéfalo o tronco cerebral craneal.10 El diagnóstico diferencial incluyó enfermedades inflamatorias multifocales-infecciosas, no infecciosas e inmunomediadas. El hemograma completo y la química sérica no fueron notables, y el análisis del líquido cefalorraquídeo (LCR) no reveló anomalías significativas. Un electroencefalograma reveló cambios sugestivos de encefalitis. Sobre la base de los signos clínicos y los resultados del electroencefalograma, el perro fue tratado por causas infecciosas de encefalitis. Durante la hospitalización en la unidad de cuidados intensivos, el perro se volvió muy excitable. El tratamiento con doxiciclina, clindamicina, diazepam, difenhidramina y líquidos no logró prevenir el aumento de la gravedad de los movimientos involuntarios y los períodos intermitentes de hipertermia (hasta 108 F/42,2 C).

La serología para Toxoplasma gondii, Neospora caninum (ProtaTek, Chandler, AZ), Ehrlichia canis y Rickettsia rickettsii (Antech, Southaven, MO) fue negativa, y los títulos de suero y LCR emparejados para el virus del moquillo canino y el parvovirus (Colorado Veterinary Diagnostic Laboratory, Ft. Collins, CO) indicó inmunidad protectora, pero no reveló la producción de anticuerpos intratecales. Después de 6 días de hospitalización y tratamiento, aproximadamente 2 semanas después del inicio de los signos clínicos, el perro fue sacrificado debido a su deterioro.

El examen de necropsia no reveló anomalías macroscópicas. El examen microscópico del cerebro reveló una meningoencefalitis leve, multifocal y no supurativa, que involucraba materia gris o áreas mixtas de materia gris / blanca, como el tronco encefálico. Esto se caracterizó por pequeños manguitos perivasculares de linfocitos dentro del parénquima y, a veces, las leptomeninges adyacentes. La microgliosis leve del neuropilo a menudo acompañaba el esposamiento perivascular (Fig. 1). Focos de inflamación, que a veces eran bilaterales, estaban presentes en el lóbulo piriforme y el giro parahippocampal y el hipocampo asociados, el puente y la médula, y la corteza cerebelosa. Una lesión única cerca de la línea media del rafe de la médula a nivel de los núcleos olivarios consistía en un área de necrosis con derrame de fibrina y hemorragia, grupos de macrófagos (células gitadoras) y muchos axones hinchados (esferoides) con un par de pequeños manguitos linfocíticos cerca (Fig. 2). Esferoides teñidos positivamente por el método de Bielschowsky para axones.19 Los únicos otros hallazgos significativos se limitaron al hígado, que mostró individualización irregular de hepatocitos, eosinofilia citoplasmática, picnosis nuclear y lisis de hepatocitos (necrosis hepática moderada difusa aguda), con numerosos hepatocitos binucleados y sin infiltración significativa de células inflamatorias. Numerosas levaduras en ciernes con pseudohifas (Candida sp.) estaban presentes en el moco gástrico sin evidencia de invasión o inflamación de la mucosa.

Fig. 1. Cerebro; perro. Pequeños manguitos perivasculares dispersos de células inflamatorias mononucleares y microgliosis leve en el lóbulo piriforme. Mancha. Bar = 35 µm.

Fig. 2. Bulbo raquídeo; perro. Un área en la línea media del rafe de la médula que muestra muchos axones hinchados (esferoides) indicados por flechas, que rodea un área de necrosis con hemorragia y macrófagos. Mancha. Bar = 70 µm.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el VNO se realizó en cerebro fijo y médula espinal no fija, hígado y riñón. Se extrajeron trozos de cerebro fijo con formalina que pesaban 30-100 mg de la médula oblonga cerca del sitio lesionado y varios otros sitios en el tronco encefálico, la corteza cerebral y el cerebelo, se enjuagaron con agua y se colocaron en el reactivo RNAlater™ (QIAgen, Valencia, CA) durante al menos 1 hora antes de la extracción del ARN. Se extrajeron muestras de médula espinal, riñón e hígado congelados sin fijar sin preprocesamiento. Las muestras de tejido se interrumpieron utilizando un mortero impulsado por motor (PelletPestle, Kontes, Vineland, NJ) y el ARN se extrajo utilizando el reactivo Trizol™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) o las mini columnas de espín RNea-sy™ (QIAgen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción en cadena de polimerasa anidada con transcriptasa inversa (rtnPCR) se realizó utilizando los cebadores anidados y una modificación del método descrito por Johnson et al., 12 con kits de reactivos comerciales (OneStep™ RT PCR, Qiagen, Valencia, CA, y Taq SuperPak™, Sigma, St. Louis, MO). El control positivo fue un 1 : 1.000 diluciones de ARN agrupado extraído de tejidos aviares no fijos con VNO positivo (predominantemente riñón y cerebro). Se detectaron bandas de ADN después de la electroforesis en gel de agarosa utilizando GelStar (Cambrex, East Rutherford, NJ). Tres de cinco piezas de médula fija con formalina dieron positivo en rtnPCR, mientras que todas las demás muestras de cerebro fijo (corteza cerebral, cerebelo y tronco encefálico) y médula espinal, riñón e hígado no fijos (congelados) fueron negativos.

Se realizó inmunohistoquímica (IHQ) en un intento de demostrar el antígeno del VNO. Se cortaron secciones de tejidos fijos en formalina, incrustados en parafina (FFPE) a 5 µm y se teñieron con un autoadherente (Dako, Carpinteria, CA) y reactivos de detección de peroxidasa de estreptavidina, biotina y rábano picante (LSAB2, Dako) preenvasados, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se teñieron secciones de cerebro, riñón, páncreas, hígado, corazón, bazo, glándula suprarrenal y lengua con anticuerpos policlonales murinos para el VNO (VR-1267-AF, ATCC, Manassas, VA) después del tratamiento previo con proteinasa K (Dako). Este anticuerpo policlonal mostró tinción de fondo difusa moderada en todos los tejidos, lo que complicó la interpretación. No se observó tinción específica, excepto posiblemente en el cerebro, donde las neuronas mostraron difusamente tinción citoplasmática ligera uniforme en comparación con los portaobjetos de control teñidos con IgG monoclonal irrelevante 1. Los resultados se consideraron equívocos debido a la alta tinción de fondo y la naturaleza difusa de la tinción neuronal, con poca variación en la intensidad. Estos resultados sugirieron una escasez de antígeno en el cerebro del perro, en comparación con los tejidos infectados de aves donde se observó una tinción citoplasmática robusta.

Las secciones cerebrales también se teñieron con anticuerpos monoclonales a la nucleoproteína del virus del moquillo canino (CDV-NP, VMRD, Pullman, WA), con resultados negativos. La IHQ en el cerebro de FFPE para el virus de la rabia se realizó en otro laboratorio (Prairie Diagnostic Service, Saskatoon, SK, Canadá), con resultados negativos.

Aunque la encefalitis mortal debida al VNO está bien documentada en muchas especies aviares,22 caballos,8 y humanos,rara vez se han documentado signos clínicos de enfermedad causada por este virus en perros. En áreas donde el VNO es endémico, una alta prevalencia de anticuerpos neutralizantes específicos indica que la infección en perros es común, incluso si la enfermedad clínica no lo es. Una encuesta serológica de Sudáfrica, donde el VNO es endémico, mostró que el 37% de los perros tenían anticuerpos neutralizantes contra el VNO.5 Una encuesta serológica en la ciudad de Nueva York, inmediatamente después de la primera identificación del VNO en el hemisferio occidental, mostró que un porcentaje más alto de perros (10%) que caballos (3%) o humanos (2,5%) tenían anticuerpos neutralizantes específicos cerca del epicentro del brote (Reinas).15 Un informe anterior de Sudáfrica describió el aislamiento de un virus, más tarde identificado como VNO, del cerebro de un perro con signos clínicos graves de encefalitis.7,21 En un experimento, la infección de tres perros con VNO produjo seroconversión asintomática en los tres, pero la viremia medible en solo uno de estos animales, que más tarde se descubrió que sufría de hiperadrenocorticismo.5 Un estudio más reciente en el que se utilizó la cepa estadounidense demostró viremia de bajo nivel en los cuatro perros y ocho gatos infectados,2 sin signos clínicos en perros y solo enfermedad febril leve y transitoria en gatos.

Se han publicado dos informes contemporáneos de infección grave por VNO en perros estadounidenses. Buckweitz et al. se describieron pruebas post mortem de replicación del VNO en muchos tejidos de un perro macho de raza mixta de 11 años de edad con enfermedad renal y del sistema nervioso central (SNC); la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RCP-RT) encontró que las secuencias virales eran más abundantes en los riñones, seguidas por el corazón, el cerebro, los pulmones y el bazo.6 Lichtensteiger y otros describir los hallazgos postmortem después de la eutanatización de un perro de raza mixta de 8 años de edad con enfermedad somática grave que incluyó miocarditis, así como encefalitis mortal por VNO en un cachorro de lobo de 3 meses de edad.18 Ambos informes documentaron secuencias de antígenos y genéticas del VNO, utilizando IHQ y RT-PCR, respectivamente, en múltiples tejidos extraneurales asociados con lesiones de necrosis e inflamación.

Este informe documenta un caso de enfermedad neurológica grave en un perro adulto joven con signos del SNC de 2 semanas de duración, en el que la evidencia de infección por el VNO se limitó al cerebro. Las lesiones histológicas en el cerebro fueron inespecíficas, pero compatibles con los hallazgos de encefalitis por VNO notificados en caballos,8 en humanos,20 y los dos informes en perros,6,18, ambos con respecto a la ubicación (tronco encefálico y médula) y el tipo (encefalitis no supurativa con áreas de necrosis). Los signos clínicos de pérdida de equilibrio (balanceo) y ataxia serían compatibles con la enfermedad cerebelomedular, mientras que los temblores en todo el cuerpo sugieren una alteración más difusa del cerebro. Se encontró evidencia de meningoencefalitis en el lóbulo piriforme y el hipocampo, el tronco encefálico y el cerebelo/médula, pero se salvó gran parte del prosencéfalo. En este caso, la necrosis hepática sin evidencia de replicación viral local (PCR e IHC negativas) se debió posiblemente a la hipertermia recurrente grave. No se puede excluir el daño hepático debido a la replicación viral previa que se eliminó durante la enfermedad, aunque no se observó inflamación. Numerosos hepatocitos binucleados sugieren daño subagudo con regeneración. La presencia de levadura Candida en el estómago se consideró un hallazgo incidental atribuible al tratamiento con antibióticos. Contrastando con los hallazgos de Buckweitz et al.6 y Lichtensteiger et al., 18 no se detectaron lesiones, ácidos nucleicos virales o antígenos virales en ningún tejido extraneural, incluidos los riñones y el hígado congelados y fijos de este perro.

El área de necrosis encontrada en el tronco encefálico de este perro se asoció con una respuesta localizada de macrófagos (células giteras), pero no con un infiltrado inflamatorio local manifiesto,lo que sugiere, como se describe en caballos, 8 que la lesión puede tener una etiología vascular o posiblemente inmunomediada en lugar de una etiología citolítica o inflamatoria directa. La CIH para el VNO en el cerebro no pudo demostrar de manera convincente el antígeno viral en este caso y en el caso reportado por Buckweitz et al., 6 indicando niveles de replicación viral más bajos que los observados en tejidos aviares, de nuevo similares a los encontrados en caballos.12 Lichtensteiger y otros18 no reportaron IHC del cerebro.

La tasa comparativamente más alta de enfermedad neurológica observada en infecciones equinas con la cepa estadounidense del VNO en comparación con las de Italia8 está respaldada por estudios experimentales en ratones, que indican que la cepa estadounidense es altamente neuroinvasiva en comparación con otras cepas.3 Estudios adicionales en ratones han demostrado que la exposición a anestésicos gaseosos y CO2 aumenta la neuroinvasión del VNO de una manera dependiente de la concentración y del tiempo,4,13, lo que sugiere que otros factores ambientales o del huésped pueden influir en el desarrollo de enfermedades neurológicas en animales. La baja incidencia de enfermedad clínica observada en perros frente a una alta seroprevalencia sugiere que los perros son más resistentes a la neuroinvasión que los humanos o los caballos.

No se encontró evidencia de infección extraneural en caballos con encefalomielitis8 como en este perro. Tal vez, en este Terrier maltés la respuesta inmune había eliminado el virus de los tejidos extraneurales. La presencia de replicación viral abundante en los tejidos extraneurales en los otros dos informes de infecciones caninas estadounidenses sugiere que alguna replicación viral ocurre en los tejidos extraneurales antes de la neuroinvasión y que el riñón y el corazón son tejidos diana probables en el perro. Buckweitz et al.6 sugieren biopsia renal para el diagnóstico de infección por VNO en perros, pero Lichtensteiger et al.18 no encontraron antígeno viral en el riñón del perro que examinaron. Aún no se ha evaluado críticamente el valor clínico de la biopsia renal o incluso de la prueba de orina para VNO, presumiblemente mediante RT-PCR.

La replicación extraneural del VNO en humanos puede extrapolarse a partir de informes de encefalitis mortal en receptores de riñones de donantes infectados que comenzaron 13-18 días después del trasplante y de encefalitis grave en un receptor de corazón,9,11 indicando que la enfermedad puede transmitirse a través de un trasplante de sangre o de órganos. Otra evidencia de replicación robusta del VNO en tejidos extraneurales de mamíferos se presenta en un informe reciente que documenta la infección mortal por el VNO en tres ardillas zorro del Este, con evidencia de replicación viral renal, cerebral, cardíaca, hepática y pulmonar.Se necesitan 14 estudios adicionales para dilucidar los detalles de la biología y fisiopatología de las infecciones por el VNO en mamíferos.

La continua importancia del VNO para la salud animal y humana en este país probablemente implicará que el virus se vuelva endémico con brotes esporádicos. Los organismos de salud pública a menudo proporcionan información oportuna sobre brotes de enfermedades humanas. Es posible que el análisis de anticuerpos contra el VNO en sueros caninos y felinos pueda proporcionar información epidemiológica valiosa sobre la propagación y la incidencia del VNO.