Como vimos en la Especiación, el principal factor para definir las especies es el aislamiento reproductivo, la falta de mestizaje con otros grupos o el aislamiento reproductivo. Este paso crucial puede ocurrir de muchas maneras diferentes. Algunos son tan dramáticos como cadenas montañosas que crecen entre poblaciones y otros son tan sutiles como la incompatibilidad química de los gametos.

Hay dos categorías principales de aislamiento reproductivo: prezigótico y postzigótico. El aislamiento precigótico se produce antes de que pueda producirse la formación de un cigoto. En la mayoría de los casos, el apareamiento ni siquiera ocurre. Las formas de aislamiento prezigótico incluyen el aislamiento espacial, conductual, mecánico y temporal. El aislamiento postcigótico ocurre después de que miembros de dos especies diferentes se hayan apareado y producido un cigoto. La descendencia de tal apareamiento se llama híbrido. Los híbridos son frecuentemente incapaces de reproducirse por sí mismos, por lo que la producción de un híbrido no se considera un apareamiento exitoso. Los híbridos se ven impedidos de reproducirse por anormalidades de desarrollo que les impiden madurar sexualmente, mala salud que causa que la mayoría muera antes de alcanzar la madurez sexual, o por esterilidad.