rotație condus de ATP hidroliză

ciclul Rotativ hidrolitic este compus din trei etape 120o în catalitic F1-domeniu al enzimei, definite în experimente de rotație biofizice de „catalitice dwells” . Fiecare etapă de 120o este împărțită în sub-etape definite de o oprire catalitică după fiecare etapă de 120o, cu o oprire de „legare ATP” intervenită la 30o și o „eliberare de fosfat” la 95o. Eliberarea fosfatului permite enzimei să finalizeze etapa de 120o și să ajungă la locul de legare ATP. Am descris structurile domeniului catalitic F1 la eliberarea fosfatului și la locuirea catalitică și am arătat că sub-etapa rotativă 35o dintre eliberarea fosfatului și locuirea catalitică depinde de eliberarea fosfatului din „legarea ATP”, care permite apoi enzimei să treacă la „locuirea catalitică” . Locuirea catalitică în sine reprezintă o tranziție în care o moleculă ATP legată devine gata pentru hidroliză. Eforturile noastre actuale sunt centrate în jurul definirii habitatului catalitic în encefalopatia F1-ATPază.

>

generarea de film de rotație 30o a subunității-aktiv în encefalopatie F1-ATPaza prin eliberarea de fosfat din subunitatea-aktiv. Filmul începe cu o vedere din partea F1-ThioP în reprezentarea panglicii, cu tiofosfatul legat ca sfere portocalii. Subunitățile de la SEC. Apoi, aTP, aDP, ßTP – și ßDP-subunități sunt eliminate succesiv lasand aEßE-dimer și centrale tulpină subunități γ, δ și ε (albastru, magenta și verde, respectiv). Acest subcomplex rezidual este rotit spre dreapta în jurul axei y cu 100 de milimetri pentru a expune o vedere laterală a subunității aE și a tulpinii centrale. Apoi, se elimină subunitățile și reziduurile de la – 42-210, iar subunitatea de la-42 devine mai slabă. În cadrele finale, fosfatul legat este eliberat și subunitatea aE se deschide și se îndepărtează de subunitatea AQC, perturbând interacțiunile de ambalare dintre subunitățile ae și AQC. Pentru a restabili aceste interacțiuni, subunitatea-subunitate-subunitate se rotește cu 30-int. Structura stării finale este starea de eliberare post-fosfat a F1-ATPazei bovine Găsită în F1-I3-Tiop.

rotația condusă de pmf

cheia care lipsește pentru înțelegerea generării de rotație din pmf este structura detaliată la nivel atomic a căii pe care protonii o iau prin domeniul membranei enzimei. Cea mai buna structura disponibila pana in prezent este cea pe care am determinat-o la rezolutia de 4 centi in 2015 prin cristalografia cu raze X a complexului enzimatic de la paracoccus denitrificans . Altele au fost determinate în 2015 și 2016 prin microscopie crioelectronică a unor particule unice ale enzimelor bovine și fungice, în cel mai bun caz la rezoluția de 6 Ecuatori . Cu toate acestea, toate aceste modele nu au detaliile necesare pentru formularea unui mecanism molecular al generării de rotație din forța motrice a protonului și, din cauza motilității și flexibilității enzimelor, particulele unice ale enzimei pot adopta multe poziții diferite. Prin urmare, prezintă o problemă neobișnuit de dificilă pentru abordarea crio-em.

figura domeniul membranei F-ATPazei din P. angusta. În A-D, subunitatea a este albastru de flori de porumb. A și B, vederi în reprezentare solidă din lateral și sub domeniul membranei. Inelul c10 este gri, subunitatea b (partea superioară nu este prezentată) este roz, iar segmentele galben pal, roșu cărămiziu, cyan deschis și bej sunt transmembranare-helice, Ch1-Ch4 atribuite subunității f, ATP8, aH1 și respectiv bH1. În C-ring, I-IV indică cele patru transmembranare C-terminal-elice-uri în contact cu subunitatea A. C și D, vederi ale subunității a în reprezentare solidă și de desene animate privite din exterior și privite din interfața cu inelul C, respectiv, cu aH1 în cyan PAL. Reziduurile polare conservate sunt galbene, pozițiile mutațiilor umane asociate patologiilor (vezi Tabelul S1) sunt roșii. Sfera roz denotă ARG-179 conservat în aH5 care este esențial pentru translocarea protonilor. Săgeata inferioară indică calea de intrare pentru protonii care se transferă la Glu-59 în terminalul c-VIII-helix-II al inelului C. Acestea sunt purtate în jurul inelului prin rotație în sens antiorar, așa cum se vede de sus, până când ajung la Arg-179 unde intră pe calea de ieșire, notată cu săgeata superioară.

structuri ale SINTAZELOR ATP bacteriene

figura Sintazelor ATP bacteriene. (A) F1-ATPază de la Caldalkalibacillus thermarum la rezoluție de 2,6 XQQ prin cristalografie cu raze X; (B) enzima ATP sintază de la paracoccus denitrificans la rezoluție de 4 XQQ prin cristalografie cu raze X; (C) ATP sintază de la Escherichia coli la rezoluție de 7 XQQ prin crioem.

comparativ cu studiile ample pe care le-am efectuat asupra enzimelor mitocondriale, structurile ATP sintazelor bacteriene au fost puțin investigate, cu excepția structurilor domeniilor catalitice F1 ale enzimelor din Escherichia coli și Geobacillus stearothermophilus (anterior Bacillus stearothermophilus) la rezoluția 3.2 și, respectiv, 3.9, și a structurilor inelelor c din domeniile lor membranare de la diferite specii . Pentru a umple această lacună , până în prezent am contribuit cu structura întregii enzime de la paracoccus denitrificans la rezoluția de 4 centi, și, în colaborare cu profesorul G. M. Cook și colegii săi din Dunedin, Noua Zeelandă, cu structurile domeniilor catalitice F1 ale ATP sintazelor de la Caldalkalibacillus thermarum, Fusobacterium nucleatum și Mycobacterium smegmatis. C. thermarum este un termoalkalifil, iar structura domeniului său catalitic la rezoluția de 2,6 Centi este cea mai precisă structură a unei F1-ATPază bacteriană încă determinată . Enzima din M. smegmatis este strâns legat de enzima din M. tuberculosis. Structura domeniului său catalitic a fost determinată la rezoluția de 4 centi și oferă o țintă pentru dezvoltarea de noi medicamente antituberculoase . Patogenul parodontal oportunist, Fusobacterium nucleatum, este asociat cu o gamă largă de boli, inclusiv infecții orale, rezultate avansate ale sarcinii, boli gastro-intestinale și ateroscleroză. De asemenea, a fost legată de dezvoltarea și progresia cancerului colorectal prin inhibarea căilor de semnalizare imună antitumorală și promovarea ulterioară a chimiorezistenței. Este un anaerob obligatoriu și cuplează energia liberă de decarboxilare a glutaconil-CoA la crotonil-CoA la transportul ionilor Na+ prin membrana sa celulară pentru a genera o forță motrice a ionilor de sodiu (smf). Sintaza ATP utilizează smf pentru a conduce sinteza ATP necesară pentru reacțiile catabolice și anabolice. Structura domeniului său F1-catalitic a fost determinată la rezoluția 3.6 . Folosind crio-EM, a fost publicată o hartă a sintazei ATP intacte A E. coli care arată subunitatea „în sus” (a se vedea mai jos) , iar recent, o structură a sintazei ATP de la Geobacillus stearothermophilus a fost determinată la 3 Int .

structura parazitului ATP sintaze

figura F1-ATPaza din Trypanosoma brucei. Α-, β-, γ-, δ-, ε-, și p18 subunități sunt roșu, galben, albastru, verde, magenta și cyan respectiv. (A și B) reprezentări de desene animate ale vederilor laterale și superioare; (C-E) reprezentări de suprafață ale (C), F1-ATPazei bovine, (D), T. enzima brucei în gri cu P18 îndepărtată și secțiunile colorate care prezintă aminoacizii suplimentari enzimei bovine și (E), enzima T. brucei cu p18 prezentă.

structurile și funcțiile componentelor ATP sintazelor, în special acele subunități implicate direct în formarea catalitică a ATP, sunt conservate pe scară largă în metazoane, ciuperci, eubacterii și cloroplaste vegetale. Pe baza unei hărți la 32.5 rezoluția In Situ determinată în mitocondriile parazitului euglenozoan, Trypanosoma brucei, prin crio-tomografie electronică, s-a propus ca ATP sintaza la această specie să aibă o structură non-canonică cu situsuri catalitice diferite, unde este furnizat degetul esențial de arginină catalitic, nu de subunitatea-XV adiacentă situsului de legare a nucleotidelor catalitice, ca la toate speciile investigate până în prezent, ci de o proteină numită p18 găsită doar în euglenozoa . Într-o colaborare cu Drs Alena Zíková și Ondřej Gahura de la Institutul de Parazitologie de la České Budějovice în cehia, ne-au caracterizat F1-atp-ază de la T. brucei și determină o structură de cristal al enzimei la 3.2 Å rezoluție . Această structură arată că propunerea conform căreia domeniul catalitic al acestei SINTAZE ATP are o structură necanonică și diferite situri catalitice este incorectă. În multe privințe, structura T. brucei F1-ATPase este strâns similară cu cea a F1-Atpazelor determinate anterior. Porțiunea sferică a domeniului catalitic, în care se găsesc cele trei situsuri catalitice, plus tulpina centrală, este foarte conservată, iar degetul de arginină este asigurat în mod convențional de subunitățile-subunități-subunități adiacente fiecăreia dintre cele trei situsuri catalitice găsite în subunitățile-subunități-subunități. Astfel, enzima are un mecanism catalitic convențional. Structura diferă de cele anterioare prin faptul că are o subunitate p18, identificată doar în euglenozoa, asociată cu suprafața exterioară a fiecăreia dintre cele trei subunități-XV, elaborând astfel domeniul F1. Subunitatea p18 este o proteină pentatricopeptidică repetată (PPR) cu trei PPR și pare să nu aibă nicio funcție în mecanismul catalitic al enzimei. T. brucei este agentul cauzal al bolii somnului la om și a bolilor conexe la animalele domestice care trăiesc în Africa Subsahariană, iar structura F1-Atpazelor sale oferă o țintă pentru dezvoltarea de noi medicamente pentru tratarea bolii.

rolul cardiolipinei

cardiolipina lipidică anionică este o componentă esențială a SINTAZELOR ATP active. În metazoane, rotoarele lor conțin un inel de opt c-subunități constând din cercuri interioare și exterioare de N – și C-terminale-helice, respectiv. Începutul C-terminal-Helix-ul conține un reziduu de lizină strict conservat și complet trimetilat în regiunea grupului capului lipidic al membranei. Inele mai mari de structură cunoscută, de la c9-c15 în eubacterii și cloroplaste, conservă fie o lizină, fie un reziduu de arginină în poziția echivalentă. În simulările computerizate ale membranelor hidratate care conțin inele C8 bovine trimetilate sau nemetilate și inele C10 sau C11 bacteriene, grupurile de cap ale moleculelor de cardiolipină s-au asociat selectiv cu aceste reziduuri de lizină modificate și nemodificate și cu aminoacizii polari adiacenți și cu o a doua lizină conservată pe partea opusă a membranei, în timp ce lipidele fosfatidil au fost atrase puțin de aceste situri .

figura moduri de legare a cardiolipinei la inelele C8 trimetilate. Spiralele N-și C-terminale ale subunităților C sunt de culoare gri închis și, respectiv, Gri deschis. Moleculele de cardiolipină sunt verzi, cu grupări fosfat roz. Sferele colorate mari reprezintă granulele grosiere pentru aminoacizii specifici, așa cum este indicat, situate la 0,7 nm de granulele fosfatice ale cardiolipinei. Părțile A și B, Regiunea grupului capului cardiolipinei din prospectul interior al membranei legate, respectiv, de două subunități c adiacente (subunitățile 8 și 1) și de o singură subunitate c; partea C, o moleculă de cardiolipină din prospectul exterior al membranei legate de o singură subunitate C. cu toate acestea, timpii de rezidență ai moleculelor de cardiolipină cu inelul au fost scurți și suficienți pentru ca rotorul să transforme doar o fracțiune de grad în enzima activă. Cu inelul C8 demetilat și cu inelele c10 și c11, densitatea moleculelor de cardiolipină legate la acest loc a crescut, dar timpii de ședere nu s – au schimbat foarte mult. Aceste interacțiuni foarte specifice, dar scurte, cu inelul c rotativ sunt în concordanță cu rolurile funcționale pentru cardiolipină în stabilizarea și lubrifierea rotorului și, prin interacțiunea cu enzima la intrarea și ieșirea canalului Proton transmembranar, în participarea la translocarea protonilor prin domeniul membranei enzimei.

simularea filmului interacțiunii cardiolipinei cu inelul nativ c8 bovin. Coloana vertebrală a proteinei este prezentată în gri deschis, cu lanțuri laterale de Lys-43 (roșu), Gln-44 (galben), Gln-45 (albastru) și Ser-48 (cyan) prezentate ca sfere. Moleculele de cardiolipină sunt prezentate ca bastoane verzi, cu fosfați ca sfere roz; moleculele POPC și POPE sunt prezentate ca bastoane gri închis cu fosfați ca sfere gri închis.