descriere și note generale

Endonucleazele de restricție (REs) sunt enzime bacteriene care scindează ADN dublu catenar. REs de tip I sunt importante în funcția bacteriană, dar nu scindează ADN-ul la secvențe specifice. REs de tip II, descris pentru utilizare în acest manual, necesită site-uri foarte specifice pentru scindarea ADN-ului și sunt, prin urmare, instrumente extrem de utile în biologia moleculară. Aceste enzime permit clonarea și purificarea fragmentelor ADN definite. Cele 500 de REs cunoscute sunt de obicei izolate dintr-o varietate de tulpini bacteriene.

REs sunt prezente în bacterii probabil pentru a distruge ADN-ul din surse străine (de exemplu, infectarea bacteriofagului) prin scindarea ADN-ului străin în locuri specifice de recunoaștere. ADN-ul bacteriilor gazdă este protejat de clivaj, deoarece site-urile specifice de recunoaștere sunt modificate, de obicei, prin metilare la una dintre bazele din site-ul, ceea ce face site-ul nu mai este un substrat pentru clivaj RE. Practic, SRE cu specificități diferite ale locului de recunoaștere au fost purificate din diferite tulpini bacteriene și sunt utilizate de biologii moleculari în condiții definite pentru a scinda ADN-ul purificat din surse eucariote în fragmente definite într-o reacție in vitro. Bacteriile gazdă utilizate pentru propagarea ADN-ului clonat în laborator sunt de obicei mutante în genele de restricție a gazdei (hsdR, hsdM sau hsdS); astfel, activitățile lor enzimatice intracelulare nu vor distruge secvențele recombinante străine.

aceste capete sunt complementare („lipicios”) și poate fi reatașat enzimatic la orice alt capăt generat de ecori folosind ligaza ADN T4. Alte REs recunosc diferite secvențe și fac clivaje unice, rezultând alte capete definite, dintre care unele au, de asemenea, 5′ capete proeminente, 3′ capete proeminente sau fără capete proeminente (contondente) (vezi Tabelul 5.1). Fiecare RE are o secvență specifică și un număr de nucleotide necesare pentru a crea site-ul de recunoaștere. Unele REs nu necesită o nucleotidă specifică în fiecare poziție a locului de recunoaștere. De exemplu, în unele cazuri este suficientă o nucleotidă purină (A sau G) într-o poziție definită. Frecvența cu care o RE va tăia ADN-ul este astfel legată de numărul de baze din secvențele de recunoaștere (dacă sunt necesare mai multe baze, se pot face mai puține tăieturi) și bazele specifice în orice poziție.

REs sunt utile deoarece specificitatea lor și terminalele ligatabile rezultate permit disecția, analiza și restructurarea ADN-ului într-o manieră controlată, previzibilă, specifică site-ului. Deoarece sunt enzime, fiecare are cerințe specifice pentru condițiile care duc la o activitate optimă de clivaj. Din fericire, mulți sunt activi în condiții similare, variabila primară fiind puterea Ionică (adică NaCl în tampon). Condițiile practice au fost definite empiric pentru utilizarea fiecărei RE ca instrument de cercetare.

cantitatea de activitate RE nu este de obicei definită folosind cinetica enzimatică clasică. Mai degrabă, activitatea RE este definită în termeni practici pentru utilizare în laborator. O unitate (U) de activitate pentru o RE este de obicei definită ca cantitatea de enzimă care va tăia 1 hectar în toate siturile specifice dintr-o probă de ADN (de obicei bacteriofagul hectar) în 1 oră la 37 centar C. Activitatea reală realizată poate fi diferită dacă sunt prezente site-uri suplimentare de digestie RE. De exemplu, dacă 1 U dintr-o RE este suficientă pentru a tăia complet 1 hectolitru de ADN bacteriofagi X9 într-un loc în condiții standard de testare, este posibil să nu fie în măsură să taie complet 1 hectolitru dintr-o probă de ADN care are patru puncte pentru o RE sau dintr-o probă care nu a fost suficient purificată.

alți factori privind condițiile de reacție afectează, de asemenea, activitatea RE. Acestea includ puritatea ADN-ului, tampon, condițiile de temperatură și RE în sine. Metilarea ADN – ului, proteina legată sau vâscozitatea excesivă a ADN-ului cu greutate moleculară mare în soluții vâscoase pot scădea eficiența unui re digest. ADN-ul care trebuie tăiat ar trebui să fie de obicei lipsit de impurități; extracția SS-fenol/cloroform și precipitarea etanolului (secțiunea 20-1) vor elimina multe impurități interferente. În schimb, majoritatea SRE nu sunt de obicei afectate negativ de ARN sau ADN monocatenar. Astfel, adăugarea Arnt ca coprecipitant poate fi utilă în recuperarea unor cantități mici de ADN fără a afecta re digerările ulterioare.

condiția tipică de testare pentru o reacție RE conține un tampon (Tris de 10 mM, pH 7, 4 este frecvent), 10 mM Mg2+ și nu conține concentrații substanțiale de agenți chelatori (tamponul TE conține o cantitate suficient de mică de EDTA). Tampoanele RE conțin, de asemenea, concentrații adecvate de sare pentru a da rezistența Ionică optimă pentru fiecare RE. În unele cazuri, se adaugă BSA, DTT și spermidină pentru a asigura o activitate enzimatică optimă. Patru tampoane re generalizate pot satisface cerințele pentru majoritatea SRE, iar pregătirea în avans a stocurilor 10 din aceste tampoane este descrisă mai jos. Cele mai multe re digerări sunt efectuate la 37 de grade C, deși există câteva excepții, cum ar fi TaqI.

majoritatea SRE achiziționate sunt livrate cu un tampon de stocare adecvat, dar acesta conține 25-50% glicerol pentru a preveni înghețarea în timpul depozitării la -20 C. concentrațiile de glicerol de peste 5% (vol / vol) în testele de digestie RE pot inhiba activitatea multor SRE. în plus, concentrațiile ridicate de glicerol în timpul digestiei RE pot relaxa specificitatea secvenței unor SRE, rezultând clivaje false. De exemplu, acest fenomen este văzut cu re EcoRI frecvent utilizat, unde activitatea falsă observată în anumite condiții se numește activitate EcoRI* (stea). Din aceste motive, este important ca volumul reacției de digestie RE să fie suficient de mare pentru a cuprinde cel puțin o diluție de 1:10 a RE în sine (și astfel să se reducă concentrația de glicerol). Alți factori, cum ar fi pH-ul, etanolul sau concentrația necorespunzătoare de sare pot provoca, de asemenea, activitate stelară sau activitate scăzută; astfel, respectarea atentă a condițiilor recomandate este importantă.

alte câteva considerații sunt utile atunci când se utilizează REs. utilizați un nou vârf de pipetă de fiecare dată când se transferă o RE. Urme de contaminant adăugat la stocul RE poate preveni utilizarea în continuare și confunda rezultatele obținute în experimentele ulterioare. La optimizarea reacțiilor, este mai bine să adăugați re suplimentară decât să incubați mult mai mult de 1 oră. mai mult, așa cum am menționat mai sus, activitatea enzimatică este definită numai pentru tăierea unui standard ADN. Deoarece eșantionul dvs. este, în general, destul de diferit de standard, un ghid bun este să utilizați aproximativ 2-3 U de RE pe microgram de ADN pentru a fi tăiat, mai ales atunci când încercați să digerați o probă dificilă. Uneori poate fi necesar să se titreze cantitatea de RE necesară pentru a digera în mod corespunzător o probă de ADN.

în cele din urmă, dacă trebuie utilizate două REs, trebuie acordată atenție condițiilor optime de sare ale fiecăruia. Dacă ambele necesită același tampon, digestia se poate face fie simultan, fie secvențial. Dacă sunt necesare condiții diferite de sare, trebuie utilizată mai întâi RE care necesită mai puțină sare. După incubare reglați starea de sare și digerați cu re care necesită sare ridicată. Activitatea RE poate fi îndepărtată prin extracția SS-fenol/cloroform în toate cazurile. Unele REs sunt termolabile și pot fi inactivate prin încălzire la 70 centimetric C timp de 5 min. Această proprietate, cu toate acestea, variază de la o RE la alta și ar trebui să fie verificate pentru fiecare re utilizate.