după introducerea unei tulpini deosebit de neuroinvazive și virulente a virusului West Nile (WNV) în nord-estul Statelor Unite, a existat un focar dramatic de infecții fatale la păsări, însoțit de un număr mult mai mic, dar alarmant de infecții fatale la cai și oameni.1,16,17,20,22 în decurs de 3 ani, noul virus Flavi a străbătut continentul nord-American, lăsând în urmă mii de păsări moarte și mii de cazuri confirmate de boală, inclusiv sute de decese la cai și oameni. Rapoartele de morbiditate și mortalitate la alte animale domestice au fost mai puțin numeroase. Cazurile aviare și ecvine au atins apogeul în Mississippi în 2002.

la începutul lunii noiembrie 2002, un terrier Maltez în vârstă de 2 ani, sterilizat, a fost prezentat medicului veterinar de referință cu un debut acut de rulare episodică, necontrolată, care a progresat rapid la tremurături și ataxie ale întregului corp. Tratamentul inițial cu fenobarbital oral și un curs scurt de prednison au dat o îmbunătățire minimă. După 1 săptămână, cazul a fost trimis la Centrul de sănătate animală, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea de Stat din Mississippi, ms. Examenul neurologic a demonstrat semne de coreeană constând în mișcări involuntare, neregulate, sacadate, care implică întregul corp. Globurile oculare au demonstrat, de asemenea, mișcări neregulate similare. Propriocepția conștientă și reacțiile de salt au fost, de asemenea, ușor scăzute la nivelul membrelor anterioare. Bolile care provoacă mișcări involuntare accidentale afectează de obicei zonele cortexului cerebral sau nucleele extrapiramidale specifice ale telencefalului sau trunchiul cerebral cranian.10 diagnosticul diferențial a inclus bolile inflamatorii multifocale-infecțioase, neinfecțioase și mediate imun. Hemoleucograma completă și chimia serică au fost nesemnificative, iar analiza lichidului cefalorahidian (LCR) nu a evidențiat anomalii semnificative. O electroencefalogramă a evidențiat modificări sugestive pentru encefalită. Pe baza semnelor clinice și a rezultatelor electroencefalogramei, câinele a fost tratat pentru cauze infecțioase ale encefalitei. În timpul spitalizării în unitatea de terapie intensivă, câinele a devenit foarte excitabil. Tratamentul cu doxiciclină, clindamicină, diazepam, difenhidramină și fluide nu a reușit să prevină creșterea severității mișcărilor involuntare și a perioadelor intermitente de hipertermie (până la 108 F/42,2 C).

serologia pentru Toxoplasma gondii, neospora caninum (ProtaTek, Chandler, AZ), Ehrlichia canis și Rickettsia rickettsii (Antech, Southaven, MO) au fost negative, iar serul asociat și titrurile CSF pentru virusul maladiei canine și parvovirusul (Colorado Veterinary Diagnostic Laboratory, Ft. Collins, CO) a indicat imunitate protectoare, dar nu a reușit să dezvăluie producția de anticorpi intratecali. După 6 zile de spitalizare și tratament, la aproximativ 2 săptămâni de la debutul semnelor clinice, câinele a fost eutanasiat din cauza stării sale deteriorate.

examenul Necropsic nu a evidențiat anomalii grave. Examinarea microscopică a creierului a evidențiat o meningoencefalită ușoară, multifocală, nonsupurativă, care a implicat materie cenușie sau zone mixte de materie cenușie/albă, cum ar fi trunchiul cerebral. Aceasta s-a caracterizat prin mici Manșete perivasculare ale limfocitelor din parenchim și uneori leptomeningele adiacente. Microglioza ușoară a neuropilului a însoțit adesea manșeta perivasculară (Fig. 1). Foci de inflamație, care au fost uneori bilaterale, au fost prezente în lobul Piriform și girusul parahippocampal asociat și hipocampul, pons și medulla și cortexul cerebelos. O leziune unică aproape de linia medulară a medulei la nivelul nucleelor olivare a constat dintr-o zonă de necroză cu revărsat de fibrină și hemoragie, grupuri de macrofage (celule gitter) și mulți axoni umflați (sferoizi) cu câteva Manșete limfocitare mici în apropiere (Fig. 2). Sferoidele colorate pozitiv prin metoda lui Bielschowsky pentru axoni.19 singurele alte constatări semnificative au fost limitate la ficat, care au arătat individualizarea neuniformă a hepatocitelor, eozinofiliei citoplasmatice, picnozei nucleare și lizei hepatocitelor (necroză hepatică moderată difuză acută), cu numeroase hepatocite binucleate și fără infiltrare celulară inflamatorie semnificativă. Numeroase drojdie înmugurire cu pseudohyphae (Candida sp.) au fost prezente în mucusul gastric fără dovezi de invazie sau inflamație a mucoasei.

Fig. 1. Cerebrum; câine. Manșete perivasculare mici împrăștiate de celule inflamatorii mononucleare și microglioză ușoară în lobul Piriform. Pătează. Bar = 35 de metri cubi.

Fig. 2. Medulla oblongata; câine. O zonă la linia mediană raphe a medulla care prezintă multe axoni umflate (sferoizi) indicat de săgeți, care înconjoară o zonă de necroză cu hemoragie și macrofage. Pătează. Bar = 70 de metri cubi.

reacția în lanț a polimerazei (PCR) pentru WNV a fost efectuată pe creier fix și măduva spinării nefixată, ficat și rinichi. Bucăți de creier fixat cu formalină cântărind 30-100 mg au fost îndepărtate din medulla oblongata în apropierea locului lezionat și din diverse alte locuri din trunchiul cerebral, cortexul cerebral și cerebel, clătite cu apă și plasate în reactivul rnalater (QIAgen, Valencia, CA) timp de cel puțin 1 oră înainte de extracția ARN. Probele de maduva spinarii, rinichi si ficat nefixate congelate au fost extrase fara preprocesare. Probele de țesut au fost întrerupte cu ajutorul unui pistil acționat de motor (PelletPestle, Kontes, Vineland, NJ), iar ARN-ul a fost extras folosind reactivul trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) sau coloanele rnea-sy mini spin (QIAGEN), conform instrucțiunilor producătorului. Reacția în lanț a transcriptazei inverse-imbricate-polimerazei (rtnPCR) a fost efectuată utilizând primerii imbricate și o modificare a metodei descrise de Johnson și colab.,12 cu kituri de reactivi comerciali (OneStep XV RT PCR, Qiagen, Valencia, CA, și Taq SuperPak XV, Sigma, St.Louis, MO). Controlul pozitiv a fost 1 : 1.000 diluție de ARN cumulat extras din țesuturile aviare WNV pozitive nefixate (predominant rinichi și creier). Benzile ADN au fost detectate după electroforeza cu gel de agaroză utilizând GelStar (Cambrex, East Rutherford, NJ). Trei din cele cinci bucăți de medulă fixă cu formalină au fost pozitive pe rtnPCR, în timp ce toate celelalte specimene de creier fix (cortexul cerebral, cerebelul și tulpina creierului) și măduva spinării nefixate (înghețate), rinichi și ficat au fost negative.

imunohistochimia (IHC) a fost efectuată în încercarea de a demonstra antigenul WNV. Secțiunile de țesuturi fixe cu formalină, încorporate în parafină (FFPE) au fost tăiate la 5 centimetri și colorate folosind un autostainer (Dako, Carpinteria, CA) și reactivi de detectare a peroxidazei streptavidin–biotină–hrean preambalați (Lsab2, Dako), conform instrucțiunilor producătorului. Secțiuni ale creierului, rinichilor, pancreasului, ficatului, inimii, splinei, glandei suprarenale și limbii au fost colorate folosind anticorp policlonal murin pentru WNV (VR-1267-AF, ATCC, Manassas, VA) după pretratamentul cu proteinaza K (Dako). Acest anticorp policlonal a prezentat o colorare difuză moderată a fundalului în toate țesuturile, complicând interpretarea. Nu s-a observat nicio colorare specifică, cu excepția posibilului în creier, unde neuronii au prezentat difuz o colorare citoplasmatică ușoară uniformă, comparativ cu diapozitivele de control colorate cu IgG1 monoclonal irelevant. Rezultatele au fost considerate echivoce din cauza colorării de fond ridicate și a naturii difuze a colorării neuronale, cu variații reduse ale intensității. Aceste rezultate au sugerat o cantitate mică de antigen în creierul câinelui, în comparație cu țesuturile aviare infectate, unde s-a observat o colorare citoplasmatică robustă.

secțiunile creierului au fost, de asemenea, colorate folosind anticorpi monoclonali pentru nucleoproteina virusului maladiei canine (CDV-NP, VMRD, Pullman, WA), cu rezultate negative. IHC pe creierul FFPE pentru virusul rabiei a fost efectuat într-un alt laborator (Prairie Diagnostic Service, Saskatoon, SK, Canada), cu rezultate negative.

deși encefalita letală datorată WNV este bine documentată la multe specii aviare,22 de cai,8 și oameni,20 de semne clinice de boală cauzate de acest virus au fost rareori documentate la câini. În zonele în care WNV este endemică, o prevalență ridicată a anticorpilor neutralizanți specifici indică faptul că infecția la câini este frecventă, chiar dacă boala clinică nu este. Un serosurvey din Africa de Sud, unde WNV este endemic, a arătat că 37% dintre câini au avut anticorpi neutralizanți la WNV.5 un serosurvey din New York, imediat după prima identificare a WNV în emisfera vestică, a arătat că un procent mai mare de câini (10%) decât caii (3%) sau oamenii (2,5%) aveau anticorpi neutralizanți specifici în apropierea epicentrului focarului (Regine).15 un raport anterior din Africa de sud a descris izolarea unui virus, identificat ulterior ca WNV, din creierul unui câine cu semne clinice severe de encefalită.7,21 într-un experiment, infecția a trei câini cu WNV a produs seroconversie asimptomatică în toate cele trei viremii, dar măsurabile, la doar unul dintre aceste animale, care ulterior s-a constatat că suferă de hiperadrenocorticism.5 Un studiu mai recent care a utilizat tulpina americană a demonstrat viremie de nivel scăzut la toți cei patru câini și opt pisici infectate, 2 fără semne clinice la câini și doar boală febrilă ușoară, tranzitorie la pisici.

au fost publicate două rapoarte contemporane de infecție severă cu WNV la câinii americani. Buckweitz și colab. s-au descris dovezi postmortem ale replicării WNV în multe țesuturi ale unui câine de 11 ani, de sex masculin, de rasă mixtă, cu boală renală și a sistemului nervos central (SNC); cantitativ reverstranscriptază-polimerază reacție în lanț (RT-PCR) a constatat că secvențele virale au fost cele mai abundente în rinichi, urmate de inimă, creier, plămân și splină.6 Lichtensteiger și colab. descrieți constatările postmortem după eutanasierea unui câine de 8 ani, de rasă mixtă, cu boală somatică severă care a inclus miocardită, precum și encefalită fatală WNV la un pui de lup de 3 luni.18 ambele rapoarte au documentat secvențe antigenice și genetice ale WNV, utilizând IHC și RT-PCR, respectiv, în mai multe țesuturi extraneurale asociate cu leziuni de necroză și inflamație.

Acest raport documentează un caz de boală neurologică severă la un câine adult tânăr cu o durată de 2 săptămâni a semnelor SNC, unde dovezile infecției cu WNV au fost limitate la creier. Leziunile histologice din creier au fost nespecifice, dar compatibile cu constatările encefalitei VWN raportate la cai,8 oameni,20 și cele două rapoarte la câini,6,18, atât în ceea ce privește localizarea (trunchiul cerebral și medulla), cât și tipul (encefalita non-supurativă cu zone de necroză). Semnele clinice de pierdere a echilibrului (rulare) și ataxie ar fi compatibile cu boala cerebellomedulară, în timp ce tremurul întregului corp sugerează o perturbare mai difuză a creierului. Dovezi ale meningoencefalitei au fost găsite în lobul Piriform și hipocampus, trunchiul cerebral și cerebelul/medulla, dar au cruțat o mare parte din prosencefal. Necroza hepatică în acest caz fără dovezi de replicare virală locală (PCR și IHC negativ) a fost posibil din cauza hipertermiei recurente severe. Leziunile hepatice datorate replicării virale anterioare care au fost eliminate în timpul bolii nu pot fi excluse, deși nu a fost evidentă nicio inflamație. Numeroase hepatocite binucleate au sugerat leziuni subacute cu regenerare. Prezența drojdiei Candida în stomac a fost considerată o constatare incidentală atribuibilă tratamentului cu antibiotice. În contrast cu constatările lui Buckweitz și colab.6 și Lichtensteiger și colab.,18 nu au fost detectate leziuni, acizi nucleici virali sau antigen viral în niciun țesut extraneural, inclusiv rinichi și ficat congelați și fixați de la acest câine.

zona de necroză Găsită în trunchiul cerebral al acestui câine a fost asociată cu un răspuns macrofag localizat (celule gitter), dar nu infiltrat inflamator local,sugerând, așa cum este descris la cai, 8 că leziunea poate avea o etiologie vasculară sau posibil mediată imun, mai degrabă decât o etiologie citolitică sau inflamatorie directă. IHC pentru WNV pe creier nu a putut demonstra convingător antigenul viral în acest caz și în cazul raportat de Buckweitz și colab., 6 indicând niveluri mai scăzute de replicare virală decât cele observate în țesuturile aviare, din nou similare cu constatările la cai.12 Lichtensteiger și colab.18 nu a raportat IHC a creierului.

rata relativ mai mare de boală neurologică observată în infecțiile ecvine cu tulpina americană de WNV comparativ cu cele din Italia8 este susținută de studii experimentale la șoareci, care indică faptul că tulpina americană este foarte neuroinvazivă în comparație cu alte tulpini.3 studii suplimentare la șoareci au demonstrat că expunerea la anestezice gazoase și CO2 crește neuroinvazia WNV într-o manieră dependentă de concentrație și timp,4,13 sugerând că alți factori de mediu sau gazdă pot influența dezvoltarea bolii neurologice la animale. Incidența scăzută a bolii clinice observată la câini în fața seroprevalenței ridicate sugerează că câinii sunt mai rezistenți la neuroinvazie decât oamenii sau caii.

nu s-au găsit dovezi de infecție extraneurală la caii cu encefalomielită WNV8 ca la acest câine. Poate că, în acest Terrier Maltez, răspunsul imun a eliminat virusul din țesuturile extraneurale. Prezența replicării virale abundente în țesuturile extraneurale în celelalte două rapoarte ale infecțiilor canine din SUA sugerează că o anumită replicare virală apare în țesuturile extraneurale înainte de neuroinvazie și că rinichii și inima sunt probabil țesuturi țintă la câine. Buckweitz și colab.6 sugerează biopsie renală pentru diagnosticul infecției cu WNV la câini, dar Lichtensteiger și colab.18 nu a găsit niciun antigen viral în rinichiul câinelui pe care l-au examinat. Valoarea clinică a biopsiei renale18 sau chiar testarea urinei pentru WNV, probabil utilizând RT-PCR, nu a fost încă evaluată critic.

replicarea Extraneurală a WNV la om poate fi extrapolată din rapoartele de encefalită fatală la destinatarii rinichilor de la donatori infectați care au început la 13-18 zile după transplant și de la encefalita severă la un recipient cardiac,9,11 indicând faptul că boala poate fi transmisă prin transplant de sânge sau de organe. Dovezi suplimentare ale replicării robuste a WNV în țesuturile extraneurale ale mamiferelor sunt prezentate într-un raport recent care documentează infecția fatală cu WNV la trei veverițe de vulpe de Est, cu dovezi ale replicării virale renale, cerebrale, cardiace, hepatice și pulmonare.Sunt necesare 14 studii suplimentare pentru a elucida detaliile biologiei și fiziopatologiei infecțiilor cu WNV la mamifere.

semnificația continuă a WNV pentru sănătatea animală și umană în această țară va implica probabil că virusul devine endemic cu focare sporadice. Agențiile de sănătate publică oferă adesea informații în timp util cu privire la focarele de boli umane. Este posibil ca analiza anticorpilor la VWN în serurile canine și feline să furnizeze informații epidemiologice valoroase privind răspândirea și incidența VWN.