DESCRIPTION AND GENERAL NOTES

Restriction endonucleases (REs) are bacterian enzymes that cleave double-stranded DNA. A REs tipo I é importante na função bacteriana, mas não divide o ADN em sequências específicas. A REs tipo II, descrita para uso neste manual, requer locais altamente específicos para clivagem de DNA e são, portanto, ferramentas extremamente úteis na biologia molecular. Estas enzimas permitem a clonagem e purificação de fragmentos de DNA definidos. As cerca de 500 REs conhecidas são tipicamente isoladas de uma variedade de estirpes bacterianas.

REs estão presentes em bactérias presumivelmente para destruir o DNA de fontes estranhas (por exemplo, infectando bacteriófago), através da clivagem do DNA estranho em locais específicos de reconhecimento. O DNA da bactéria hospedeira é protegido da clivagem porque os locais de reconhecimento específicos são modificados, geralmente por metilação em uma das bases no local, tornando o local não mais um substrato para re clivagem. Na prática, as REs com diferentes especificidades do local de reconhecimento foram purificadas a partir de várias estirpes bacterianas e são utilizadas por biólogos moleculares em condições definidas para separar o ADN purificado de fontes eucarióticas em fragmentos definidos numa reacção in vitro. As bactérias hospedeiras utilizadas para propagar ADN clonado em laboratório são geralmente mutantes nos genes de restrição do hospedeiro (hsdR, hsdM, ou hsdS); assim, as suas actividades enzimáticas intracelulares não destruirão as sequências recombinantes estranhas.

Esses fins são complementares (“pegajoso”) e pode ser carboximetilcelulose recolocado para qualquer outro EcoRI-gerado termini, o uso de T4 DNA ligase. Outras REs reconhecem sequências diferentes e fazem clivagens únicas resultando em outras terminações definidas, algumas das quais também têm 5′ extremidades salientes, 3′ extremidades salientes, ou nenhuma extremidade saliente (contundente) (Ver quadro 5.1). Cada RE tem uma sequência específica e número de nucleótidos necessários para criar o local de reconhecimento. Algumas REs não requerem um nucleótido específico em cada posição do local de reconhecimento. Por exemplo, em alguns casos um nucleótido purina (A ou G) em uma posição definida é suficiente. A frequência com que um RE cortará o DNA está assim relacionada com o número de bases nas sequências de reconhecimento (se mais bases são necessárias, menos cortes são apt a ser feitos) e as bases específicas em qualquer posição.

REs são úteis porque sua especificidade e a termini ligável resultante permitem a dissecação, análise e reestruturação do DNA de uma maneira controlada, previsível e específica do local. Uma vez que são enzimas, cada uma delas tem requisitos específicos para as condições que conduzem a uma actividade de clivagem óptima. Felizmente, muitos estão ativos em condições semelhantes, com a variável primária sendo a força iônica (isto é, NaCl no buffer). As condições práticas foram definidas empiricamente para utilizar cada RE como uma ferramenta de investigação.a quantidade de actividade RE não é normalmente definida utilizando cinética enzimática clássica. Pelo contrário, a actividade de investigação é definida em termos práticos para utilização no laboratório. Uma unidade (U) de actividade para um RE é normalmente definida como a quantidade de enzima que irá cortar 1 µg em todos os locais específicos de uma amostra de ADN (geralmente bacteriofágico λ) EM 1 h a 37°C. A actividade real atingida pode ser diferente se estiverem presentes locais de RE digestão adicionais. Por exemplo, se 1 U de um RE for suficiente para cortar completamente 1 µg de ADN bacteriofágico λ num local em condições normais de ensaio, pode não ser capaz de cortar completamente 1 µg de uma amostra de ADN que tenha quatro locais para um RE, ou de uma amostra que não tenha sido suficientemente purificada.outros factores relacionados com as condições de reacção também afectam a RE actividade. Estes incluem a pureza do DNA, tampão, condições de temperatura, e o próprio RE. A metilação do ADN, a proteína ligada ou a viscosidade excessiva do ADN de alto peso molecular em soluções viscosas podem diminuir a eficiência de uma RE digestão. O ADN a cortar deve normalmente estar isento de impurezas; a extracção de SS-fenol/clorofórmio e a precipitação de etanol (secção 20-1) irão remover muitas impurezas interferentes. Em contraste, a maioria das REs não são geralmente afetadas adversamente pelo RNA ou DNA de cadeia única. Assim, a adição de tRNA como coprecipitant pode ser útil na recuperação de pequenas quantidades de ADN sem afectar re digests subsequentes.

a condição típica do ensaio para uma reacção RE contém um tampão (Tris de 10 mM, o pH 7.4 é comum), 10 mM Mg2+ e está isento de concentrações substanciais de agentes quelatantes (o tampão TE contém uma quantidade suficientemente baixa de EDTA). Os tampões RE também contêm concentrações de sal adequadas para dar a força iónica ideal para cada RE. Em alguns casos, a ASC, a TDT e a espermidina são adicionadas para proporcionar uma actividade enzimática óptima. Quatro tampões de choque generalizados podem satisfazer os requisitos para a maioria das fre, e a preparação antecipada de 10 × Reservas destes tampões é descrita a seguir. A maioria dos re digests são realizados a 37 ° C, embora haja algumas exceções, como TaqI.

Mais comprado REs são enviados com um buffer de armazenamento, mas este contém 25-50% de glicerol para evitar o congelamento durante o armazenamento a -20°C. as Concentrações de glicerol, de mais de 5% (vol/vol) em RE ensaios de digestão pode inibir a atividade de muitas REs. Além disso, altas concentrações de glicerol durante a RE digestão pode relaxar a sequência da especificidade de algumas REs, resultando em falsos clivagens. Por exemplo, este fenômeno é visto com o RE EcoRI comumente usado, onde a atividade espúria observada em algumas condições é chamada atividade EcoRI* (estrela). Por estas razões, é importante que o volume da reacção à RE digestão seja suficientemente grande para abranger pelo menos uma diluição de 1:10 da própria RE (reduzindo assim a concentração de glicerol). Outros fatores, tais como pH, etanol, ou concentração imprópria de sal também podem causar atividade estelar ou diminuição de atividade; assim, a adesão cuidadosa às condições recomendadas é importante.

algumas outras considerações são úteis ao usar REs. utilize uma nova ponta de pipeta cada vez que um RE é transferido. Quantidades vestigiais de contaminante adicionadas ao estoque de RE podem impedir o seu uso adicional e confundir os resultados obtidos em experimentos subsequentes. Ao otimizar as reações, é melhor adicionar RE adicional do que incubar por muito mais tempo do que 1 h. Além disso, como mencionado acima, a atividade enzimática é definida apenas para cortar um padrão de DNA. Porque sua amostra é geralmente bastante diferente do padrão, um bom guia é usar cerca de 2-3 U de RE por micrograma de DNA a ser cortado, especialmente quando se tenta digerir uma amostra difícil. Por vezes, pode ser necessário titular a quantidade de RE necessária para digerir adequadamente uma amostra de ADN.finalmente, se forem utilizadas duas REs, deve ter-se em atenção as condições de sal óptimas de cada uma. Se ambos requererem o mesmo tampão, a digestão pode ser feita simultaneamente ou sequencialmente. Se forem necessárias condições de sal diferentes, deve utilizar-se primeiro o RE que requer menos sal. Após a incubação ajustar a condição de sal, e digerir com o RE requerendo alto sal. A actividade de RE pode ser removida por extracção de SS-fenol / clorofórmio em todos os casos. Algumas REs são termolábeis e podem ser inativadas por aquecimento a 70 ° C durante 5 minutos. Esta propriedade, no entanto, varia de um RE para o próximo e deve ser verificada para cada RE usado.