Após a introdução de um particularmente neuroinvasive e virulento do vírus do Nilo Ocidental (WNV) no nordeste dos Estados Unidos, houve uma dramática surto de infecções fatais em aves, acompanhado por mais pequeno, mas números alarmantes de infecções fatais em cavalos e seres humanos.1.16,17,20,22 em 3 anos, o recém-introduzido vírus Flavi havia varrido o continente norte-americano, deixando em seu rastro milhares incontáveis de aves mortas e milhares de casos confirmados de doença, incluindo centenas de mortes em cavalos e humanos. Os relatos de morbilidade e mortalidade em outros animais domésticos têm sido menos numerosos. Avian and equine cases peaked in Mississippi during 2002.
no início de novembro de 2002, um Terrier Maltês de 2 anos foi apresentado ao veterinário de referência com um início agudo de rolamento episódico e não controlado, que progrediu rapidamente para tremores de todo o corpo e ataxia. O tratamento inicial com fenobarbital oral e um curto ciclo de prednisona deram uma melhoria mínima. Após uma semana, o caso foi referido ao Animal Health Center, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University, MS. O exame neurológico demonstrou sinais de Corea consistindo em movimentos involuntários, irregulares e acidentais que envolvem todo o corpo. Os globos oculares também demonstraram movimentos erráticos semelhantes. As reações conscientes de propriocepção e salto também foram ligeiramente diminuídas nos membros dianteiros. Doenças que causam movimentos involuntários adventícios geralmente afetam áreas do córtex cerebral, ou núcleos extrapiramidais específicos do telencéfalo, ou brainstem cranial.O diagnóstico diferencial incluiu doenças inflamatórias multifocais—infecciosas, não-infecciosas e imunomediadas. A contagem sanguínea completa e os testes séricos não foram relevantes, e a análise do líquido cefalorraquidiano (LCR) não revelou anomalias significativas. Um electroencefalograma revelou alterações sugestivas de encefalite. Com base nos sinais clínicos e nos resultados do electroencefalograma, o cão foi tratado por causas infecciosas de encefalite. Durante a hospitalização na unidade de cuidados intensivos, o cão tornou-se muito excitável. O tratamento com doxiciclina, clindamicina, diazepam, difenidramina e Fluidos não conseguiu prevenir o aumento da gravidade dos movimentos involuntários e períodos intermitentes de hipertermia (até 108 F/42, 2 c).
A Serologia para Toxoplasma gondii, Neospora caninum (ProtaTek, Chandler, AZ), Ehrlichia canis, e Rickettsia rickettsii (Antech, Southaven, MO) foi negativa, e os títulos de soro e LCR emparelhados para o vírus distemper canino e parvovírus (Colorado Veterinary Diagnostic Laboratory, Ft. Collins, CO) indicou imunidade protectora, mas não revelou a produção de anticorpos intratecais. Após 6 dias de hospitalização e tratamento, aproximadamente 2 semanas após o início dos sinais clínicos, o cão foi eutanatizado devido à sua deterioração condição.o exame da autópsia não revelou anomalias graves. O exame microscópico do cérebro revelou uma leve, multifocal, meningoencefalite não supurativa, que envolvia matéria cinzenta ou áreas mistas de matéria cinzenta/branca, como o tronco cerebral. Isto foi caracterizado por pequenas algemas perivasculares de linfócitos dentro do parênquima e às vezes as leptomeninges adjacentes. Microgliose leve do neuropil muitas vezes acompanhava o abafamento perivascular (Fig. 1). Focos de inflamação, que eram por vezes bilaterais, estavam presentes no lobo piriforme e associado giro parahippocampal e hipocampo, os pons e a medula, e o córtex cerebelar. Uma lesão única perto da linha média da medula no nível dos núcleos Olivares consistiu em uma área de necrose com efusão de fibrina e hemorragia, aglomerados de macrófagos (células de gitter), e muitos axônios inchados (esferóides) com um par de pequenas algemas linfocíticas próximas (Fig. 2). Spheroids stained positively by the Bielschowsky’s method for axons.Os únicos outros resultados significativos foram limitados ao fígado, que mostraram individualização irregular dos hepatócitos, eosinofilia citoplasmática, piknose nuclear e lise de hepatócitos (necrose hepática moderada difusa aguda), com numerosos hepatócitos binucleados e sem infiltração celular inflamatória significativa. Numerosas leveduras nascidas com pseudohyphae (Candida sp.) estiveram presentes no muco gástrico sem evidência de invasão das mucosas ou inflamação.
Fig. 1. Cérebro, cão. Pequenas algemas perivasculares espalhadas de células inflamatórias mononucleares e microgliose ligeira no lobo piriforme. Ele mancha. Bar = 35 µm.
Fig. 2. Medulla oblongata; cão. Uma área na linha média da medula mostrando muitos axônios inchados (esferóides) indicados por flechas, circundando uma área de necrose com hemorragia e macrófagos. Ele mancha. Bar = 70 µm.
polimerase em cadeia (PCR) para WNV foi realizada em cérebro fixo e espinal medula não fixada, fígado e rim. Pedaços de cérebro fixo com formalina, pesando 30-100 mg, foram removidos do medulla oblongata perto do local lesionado e de vários outros locais no tronco cerebral, córtex cerebral e cerebelo, lavados com água, e colocados em reagente RNAlater™ (QIAgen, Valencia, CA) durante pelo menos 1 hora antes da extração de ARN. Amostras de espinal medula, rim e fígado congelados não misturados foram extraídas sem pré-processamento. As amostras de tecidos foram interrompidas usando um pilão motorizado (PelletPestle, Kontes, Vineland, NJ), e o RNA foi extraído usando reagente Trizol™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) ou mini colunas de spin RNea-sy™ (QIAgen), de acordo com as instruções do fabricante. A reacção em cadeia da transcriptase reversa com polimerase aninhada (rtnPCR) foi realizada utilizando os iniciadores aninhados e uma modificação do método descrito por Johnson et al.,12 com kits de reagente comercial (OneStep™ RT PCR, Qiagen, Valencia, CA, e Taq SuperPak™, Sigma, St.Louis, MO). O controlo positivo foi um 1 : 1000 diluição de ARN agrupado extraído de tecidos aviários não fixos WNV positivos (predominantemente rim e cérebro). Foram detectadas Bandas de ADN após a electroforese em gel de agarose utilizando GelStar (Cambrex, East Rutherford, NJ). Três dos cinco pedaços de medula fixa de formalina foram positivos na rtnPCR, enquanto todos os outros espécimes de cérebro fixo (córtex cerebral, cerebelo e tronco cerebral) e medula espinhal, rim e fígado não fixos (congelados) foram negativos.a imunohistoquímica (IHC) foi realizada numa tentativa de demonstrar o antigénio WNV. Seções do fixadas em formol, incluídas em parafina (FFPE) os tecidos foram cortados a 5 µm e corados utilizando um autostainer (Dako, Carpinteria, CA) e pacotes de estreptavidina–biotina–peroxidase de rábano reagentes de detecção (LSAB2, Dako), de acordo com as instruções do fabricante. Secções do cérebro, rim, pâncreas, fígado, coração, baço, glândula supra-renal e língua foram manchadas utilizando anticorpos policlonais murinos para o VNV (VR-1267-AF, ATCC, Manassas, VA) após pré-tratamento com proteinase K (Dako). Este anticorpo policlonal mostrou coloração de fundo difusa moderada em todos os tecidos, complicando a interpretação. Não foi observada qualquer coloração específica, excepto possivelmente no cérebro, onde os neurónios mostraram difusamente manchas citoplasmáticas de luz uniformes em comparação com lâminas de controlo manchadas com IgG1 monoclonal irrelevante. Os resultados foram considerados equívocos devido à coloração de fundo elevada e à natureza difusa da coloração neuronal, com pouca variação na intensidade. Estes resultados sugeriram uma paucidade do antigénio no cérebro do cão, quando comparado com os tecidos aviários infectados, onde foi observada coloração citoplásmica robusta.as secções cerebrais
também foram manchadas utilizando anticorpos monoclonais para a nucleoproteína do vírus distemper canino (CDV-NP, VMRD, Pullman, WA), com resultados negativos. A IHC no FFPE brain for rabies virus foi realizada em outro laboratório (Prairie Diagnostic Service, Saskatoon, SK, Canadá), com resultados negativos.apesar de a encefalite fatal devida a VQN estar bem documentada em muitas espécies aviárias,22 cavalos,8 e humanos,20 sinais clínicos de doença causada por este vírus raramente foram documentados em cães. Em áreas onde WNV é endêmica, uma alta prevalência de anticorpos neutralizantes específicos indica que a infecção em cães é comum, mesmo que a doença clínica não é. Um serosurvey da África do Sul, onde o WNV é endêmico, mostrou que 37% dos cães tinham anticorpos neutralizantes do WNV.5 um serosurvey em Nova York, imediatamente após a primeira identificação do WNV no hemisfério ocidental, mostrou que uma maior porcentagem de cães (10%) do que cavalos (3%) ou humanos (2,5%) tinha anticorpos neutralizantes específicos perto do epicentro do surto (rainhas).15 um relatório anterior da África do Sul descreveu o isolamento de um vírus, posteriormente identificado como WNV, a partir do cérebro de um cão com graves sinais clínicos de encefalite.7,21 Em um experimento, infecção de três cães com o WNV produzido assintomáticos soroconversão em todos os três, mas mensurável, virose em apenas um destes animais, que posteriormente foi encontrado a sofrer de hyperadrenocorticism.Um estudo mais recente utilizando a estirpe dos EUA demonstrou níveis baixos de viremia em todos os quatro cães e oito gatos infectados,2 sem sinais clínicos em cães e apenas doença febril ligeira e transitória em Gatos.foram publicadas duas notificações contemporâneas de infecção grave por WNV em cães dos EUA. Buckweitz et al. descreveu evidências pós-morte de replicação em muitos tecidos de um cão de raça mista de 11 anos com doença renal e do sistema nervoso central (SNC); reação quantitativa em cadeia da transcriptase reversa–polimerase (RT-PCR) descobriu que as sequências virais eram mais abundantes no rim, seguido de coração, cérebro, pulmão e baço.6 Lichtensteiger et al. descreva os achados pós-morte após eutanásia de um cão de 8 anos de raça mista com doença somática grave que incluiu miocardite, bem como encefalite WNV fatal em um filhote de lobo de 3 meses de idade.Ambos os relatórios documentaram sequências de antigénios e genéticas do VQN, utilizando IHC e RT-PCR, respectivamente, em tecidos extraneurais múltiplos associados a lesões de necrose e inflamação.este relatório documenta um caso de doença neurológica grave num cão adulto jovem com uma duração de 2 semanas de sinais do SNC, em que a evidência de infecção por WNV foi limitada ao cérebro. As lesões histológicas no cérebro foram não específicas mas compatíveis com os achados de encefalite WNV relatados em cavalos,8 humanos,20 e os dois relatórios em cães,6,18 tanto no que diz respeito à localização (tronco cerebral e medula) e tipo (encefalite não supurativa com áreas de necrose). Os sinais clínicos de perda de equilíbrio (rolamento) e ataxia seriam compatíveis com a doença cerebelomedular, enquanto os tremores do corpo inteiro sugerem uma perturbação mais difusa do cérebro. Evidências de meningoencefalite foram encontradas no lobo piriforme e no hipocampo, tronco cerebral e cerebelo/medula, mas pouparam grande parte do prosencéfalo. A necrose hepática neste caso sem evidência de replicação viral local (PCR e IHC negativo) foi possivelmente devido à hipertermia recorrente grave. Os danos hepáticos devido à replicação viral anterior que foi eliminada durante a doença não podem ser excluídos, embora não tenha sido aparente qualquer inflamação. Numerosos hepatócitos binucleados sugerem danos subagudos com regeneração. A presença de levedura Candida no estômago foi considerada um achado incidental atribuível ao tratamento com antibióticos. Contrastando com as conclusões de Buckweitz et al.6 and Lichtensteiger et al., 18 não foram detectadas lesões, ácidos nucleicos virais, ou antigénio viral em quaisquer tecidos extraneurais, incluindo rim e fígado congelados e fixos deste cão.
A área de necrose encontrado no tronco encefálico de este cão foi associado com um localizadas resposta de macrófagos (células gitter), mas não evidente local infiltrado inflamatório sugerindo, como descrito em cavalos,8 que a lesão pode ter uma vascular ou possivelmente imune-mediada etiologia, ao invés de incluir um direto citolíticas ou inflamatória de etiologia. A IHC do WNV no cérebro foi incapaz de demonstrar convincentemente o antigénio viral neste caso e no caso relatado por Buckweitz et al., 6 indicando níveis de replicação viral inferiores aos observados nos tecidos aviários, mais uma vez semelhantes aos observados nos cavalos.12 Lichtensteiger et al.18 não relatou IHC do cérebro.
a taxa comparativamente mais elevada de doença neurológica observada em infecções equinas com a estirpe WNV dos EUA, em comparação com a Italy8, é suportada por estudos experimentais em ratinhos, que indicam que a estirpe dos EUA é altamente neuroinvasiva em comparação com outras estirpes.3 estudos adicionais em ratinhos demonstraram que a exposição a anestésicos gasosos e ao CO2 aumentam a neuroinvasão WNV de forma dependente da concentração e do tempo,4,13 sugerindo que outros factores ambientais ou hospedeiros podem influenciar o desenvolvimento de doenças neurológicas em animais. A baixa incidência de doença clínica observada em cães face a uma seroprevalência elevada sugere que os cães são mais resistentes à neuroinvasão do que os seres humanos ou os cavalos.não foram encontradas provas de infecção extraneural em cavalos com encefalomielitis8 WNV, tal como neste cão. Talvez, neste Terrier Maltês, a resposta imunitária tenha eliminado o vírus dos tecidos extraneurais. A presença de replicação viral Abundante nos tecidos extraneurais nos dois outros relatórios de infecções caninas nos EUA sugere que alguma replicação viral ocorre nos tecidos extraneurais antes da neuroinvasão e que o rim e o coração são, provavelmente, tecidos alvo no cão. Buckweitz et al.6 sugerem biópsia renal para o diagnóstico de infecção por WNV em cães, mas Lichtensteiger et al.18 não encontrou antigénio viral no rim do cão que eles examinaram. O valor clínico da biopsy18 renal ou mesmo dos testes urinários para VN, presumivelmente utilizando RT-PCR, ainda não foi avaliado criticamente.
Extraneural replicação do VÍRUS do nilo ocidental em seres humanos pode ser extrapolado a partir de relatórios de encefalite fatal em receptores de rins de doadores infectados, que começou 13-18 dias após o transplante e da encefalite grave no coração, destinatário,9,11, indicando que a doença pode ser transmitida através de sangue ou transplante de órgão. Outras evidências de replicação robusta de WNV em tecidos extraneurais de mamíferos são apresentadas em um relatório recente documentando infecção fatal de WNV em três esquilos da raposa Oriental, com evidências de replicação renal, cerebral, cardíaca, hepática e pulmonar viral.14 estudos adicionais são necessários para elucidar os detalhes da biologia e fisiopatologia das infecções por VQN em mamíferos.
a importância continuada da VQM para a saúde animal e humana neste país irá provavelmente envolver o vírus que se torna endémico com surtos esporádicos. As agências de saúde pública fornecem frequentemente informações atempadas sobre surtos de doenças humanas. É possível que a análise de anticorpos contra WNV em soros caninos e felinos possa fornecer informações epidemiológicas valiosas sobre a propagação e incidência de WNV.agradecemos a Stephanie Mays e Chelsea Miller pela assistência técnica e o sistema de Diagnóstico Veterinário Mississippi para apoio financeiro.Anderson, JF, Andreadis, TG, Vossbrinck, CR, Tirrell, S, Wakem, em, French, RA, Garmendia, AE, Van Kruiningen, HJ: Isolation of West Nile virus from mosquitos, crows, and a Cooper’s hawk in Connecticut. Ciência 286:2331-2333, 1999
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