Rotation driven by ATP hydrolysis
o ciclo rotativo hidrolítico é composto por três etapas no domínio F1 catalítico da enzima, definido em experiências de rotação Biofísica por “dwells catalíticos” . Cada etapa de 120o é dividida em sub-etapas definidas por um salto catalítico após cada etapa de 120o, com um intervalo de “ligação ATP” habitar em 30o e uma “libertação de fosfato” habitar em 95o. A libertação de fosfato permite que a enzima complete o passo 120o e chegue ao ensaio de ligação ATP. Nós descrevemos as estruturas do domínio F1-catalítico na libertação de fosfato e habita cataliticamente, e temos mostrado que o sub-passo rotativo 35o entre a libertação de fosfato e os dwells catalíticos depende da libertação de fosfato a partir do “ATP binding” dwell, que então permite que a enzima avance para o “dwell catalítico” . O próprio dwell catalítico representa uma transição onde uma molécula ATP ligada se torna poisada para hidrólise. Os nossos esforços actuais centram-se na definição do alojamento catalítico na encefalopatia F1-ATPase.
Filme Geração de 30o rotação da γ-subunidade de encefalopatia F1-ATPase pela liberação de fosfato de ßE subunidade. O filme começa com uma visão do lado de F1-Tiop na representação da fita, com o tiofosfato ligado como esferas laranja. As subunidades α e β são vermelhas e amarelas, respectivamente. Em seguida, as subunidades aTP, aDP, ßTP e ßDP são removidas sequencialmente deixando o dímero de aEßE e as subunidades de Halo Central γ, δ e ε (azul, magenta e verde, respectivamente). Este subcomplex residual é virado para a direita em torno do eixo y em 100° para expor uma visão lateral da subunidade aE e do caule central. Em seguida, as subunidades δ e ε e os resíduos γ – 42-210 são removidos, e a subunidade ßE torna-se mais fraca. Nos quadros finais, o fosfato ligado é libertado e a subunidade aE-abre-se e afasta – se da subunidade γ, interrompendo as interacções de embalagem entre as subunidades aE e γ -. A fim de restabelecer essas interações, a subunidade γ gira em 30°. A estrutura do estado final é o estado de libertação pós-fosfato da F1-ATPase bovina encontrado em F1-I3-Tiop.
rotação impulsionada por pmf
o dado chave em falta para compreender a geração de rotação a partir do pmf é a estrutura detalhada a nível atómico da via que os protões levam através do domínio de membrana da enzima. A melhor estrutura disponível até à data é aquela que determinamos em 4 Å resolution em 2015 por cristalografia de raios X do complexo enzimático de Paracoccus denitrificans . Outros foram determinados em 2015 e 2016 por microscopia crio-eletrônica de partículas únicas das enzimas bovinas e fúngicas, na melhor das hipóteses com resolução de 6 Å . No entanto, todos estes modelos carecem dos detalhes necessários para a formulação de um mecanismo molecular da geração de rotação a partir da força motriz proton, e, devido à mobilidade das enzimas e flexibilidade, partículas únicas da enzima podem adotar muitas posições diferentes. Portanto, apresenta um problema invulgarmente difícil para a abordagem crio-em.figura o domínio de membrana da F-ATPase a partir de P. angusta. Em A-D, a subunidade a é azul flor de milho. A E B, vistas em representação sólida do lado, e abaixo do domínio da membrana. O anel c10 é cinzento, a subunidade b (parte superior não mostrada) é rosa, e os segmentos amarelo-pálido, vermelho-tijolo, ciano claro e beige são hélices α transmembranas, Ch1-Ch4 atribuídos à subunidade f, ATP8, aH1 e bH1, respectivamente. No anel c, I-IV indicam as quatro hélices transmembranas C-terminal em contato com subunidades A. C e D., vistas da subunidade A-em representação sólida e cartoon vistas de fora e olhando para fora da interface com o anel c, respectivamente, com aH1 em ciano pálido. Os resíduos polares conservados são amarelos, as posições das mutações humanas associadas com patologias (Ver Tabela S1) são vermelhas. A esfera rosa denota o Arg-179 conservado em aH5 que é essencial para a translocação de prótons. A seta inferior indica a via de entrada dos protões que se transferem para o Glu-59 no terminal C α-helix-II do anel C. Eles são carregados ao redor do anel por rotação anti-horário como visto de cima, até que eles chegam ao Arg-179 onde eles entram no caminho de saída, denotado pela seta superior.
estruturas de ATP sintases bacterianas
Figura de ATP sintases bacterianas. (A) F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum at 2.6 Å resolution by X-ray crystallography; (B) ATP synthase enzyme from Paracoccus denitrificans at 4 Å resolution by X-ray crystallography; (C) ATP synthase from Escherichia coli at 7 Å resolution by crio-EM.
em relação à extensa estudos que temos realizado no enzimas mitocondriais, as estruturas bacterianas ATP synthases têm sido pouco investigados, exceto para estruturas de F1 catalítico de domínios de enzimas a partir de Escherichia coli e de Geobacillus stearothermophilus (anteriormente Bacillus stearothermophilus) 3,2 e 3,9 Å de resolução, respectivamente, e as estruturas do c-anéis de sua membrana domínios a partir de várias espécies . A fim de preencher esta lacuna, até agora, temos contribuído com a estrutura de toda a enzima de Paracoccus denitrificans em 4 Å de resolução , e, em colaboração com o Professor G. M. Cook e seus colegas em Dunedin, na Nova Zelândia, as estruturas da F1 catalítico domínios da ATP synthases de Caldalkalibacillus thermarum, Fusobacterium nucleatum e Mycobacterium smegmatis. C. thermarum é um termoalkalifile, e a estrutura de seu domínio catalítico a 2,6 Å resolução é a estrutura mais precisa de uma F1-ATPase bacteriana ainda determinada . A enzima de M. o smegmatis está intimamente relacionado com a enzima de M. tuberculosis. A estrutura do seu domínio catalítico foi determinada para 4 Å resolução e fornece um alvo para o desenvolvimento de novas drogas anti-tuberosas . O patogénico periodontal oportunista, Fusobacterium nucleatum, está associado a uma vasta gama de doenças, incluindo infecções orais, resultados de gravidez antecipados, doenças gastrointestinais e aterosclerose. Além disso, tem sido associado ao desenvolvimento e progressão do cancro colorectal através da inibição das vias imunitárias de sinalização anti-tumoral e da subsequente promoção da quimiorresistência. É um anaeróbio obrigatório e casais a energia livre de decarboxilação de glutaconil-CoA para crotonil-CoA para o transporte de íons Na+ através de sua membrana celular para gerar uma força motriz iônica de sódio (smf). A ATP sintase usa o smf para conduzir a síntese de ATP necessária para reações catabólicas e anabólicas. A estrutura do seu domínio F1-catalítico foi determinada em 3.6 Å resolução . Usando crio-em , um mapa da ATP sintase intacta de E. coli foi publicado mostrando a subunidade ε Na posição “up” (ver abaixo), e recentemente, uma estrutura da ATP sintase de Geobacillus stearothermophilus foi determinada para 3 Å .
estrutura do parasita ATP sintases
figura a F1-ATPase de Trypanosoma brucei. As subunidades α-, β-, γ-, δ-, ε-e p18 são vermelhas, amarelas, azuis, verdes, magenta e ciano, respectivamente. (A E B) representações de Desenhos Animados das vistas laterais e superiores; (C-e) representações de superfície de (c), o bovino F1-ATPase, (D), O T. enzima brucei de cor cinzenta com remoção de p18 e secções coloridas que apresentam os aminoácidos adicionais à enzima bovina, e e) a enzima T. brucei com presença de p18.
As estruturas e funções dos componentes das ATP sintases, especialmente as subunidades envolvidas diretamente na formação catalítica de ATP, são amplamente conservadas em metazoários, fungos, eubactérias e cloroplastos vegetais. Com base num mapa a 32.5 Å de resolução de determinada in situ nas mitocôndrias das euglenozoan do parasita Trypanosoma brucei, elétrons cryo-tomografia, tem sido proposto que a ATP sintase em que esta espécie tem um não-canônico estrutura com diferentes sítios catalíticos, onde o catalytically essenciais arginina-dedo é fornecido, não pela subunidade adjacentes para o catalisador de nucleotídeos sítio de ligação, como em todas as espécies investigadas para a data, mas por uma proteína chamada p18 encontrado apenas no euglenozoa . Em colaboração com o Drs Alena Zíková e Ondřej Gahura do Instituto de Parasitologia em České Budějovice, na República checa, temos caracterizada a F1-ATPase de T. brucei e determinou a estrutura cristalina da enzima de 3,2 Å de resolução . Esta estrutura mostra que a proposta de que o domínio catalítico desta ATP sintase tem uma estrutura não canônica e diferentes sites catalíticos é incorreta. Em muitos aspectos, a estrutura do T. brucei F1-ATPase é muito semelhante à das F1-ATPases determinadas anteriormente. A porção α3β3-esférica do domínio catalítico, onde os três locais catalíticos são encontrados, mais o pedúnculo central, são altamente conservados, e o dedo arginino é fornecido convencionalmente pelas subunidades α adjacentes a cada um dos três locais catalíticos encontrados nas subunidades β. Assim, a enzima tem um mecanismo catalítico convencional. A estrutura difere das anteriores por ter uma subunidade p18, identificada apenas no euglenozoa, associada com a superfície externa de cada uma das três subunidades α, elaborando assim o domínio F1. A subunidade p18 é uma proteína pentatricopeptida repeat (PPR) com três PPRs e parece não ter função no mecanismo catalítico da enzima. T. brucei é o agente causador da doença do sono em seres humanos e doenças relacionadas em animais domésticos que vivem na África Subsaariana, e a estrutura de seus F1-ATPases fornece uma meta para o desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento da doença.
o papel da cardiolipina
a cardiolipina lipídica aniónica é um componente essencial das ATP sintetases activas. Em metazoanos, seus rotores contêm um anel de oito subunidades c consistindo de círculos internos e externos de α – hélices N-E C-terminal, respectivamente. O início Da α-helix terminal C contém um resíduo de lisina estritamente conservado e totalmente trimetilado na região do grupo lipídico da membrana. Anéis maiores de estrutura conhecida, de c9-c15 em eubacteria e cloroplastos, conservam ou uma lisina ou um resíduo de arginina na posição equivalente. Em simulações no computador de silicatos hidratados de membranas contendo trimethylated ou não metilado bovina c8-anéis, e bacterianas c10 – ou c11-anéis, o cabeça-de grupos de cardiolipina moléculas tornou-se associado de forma selectiva com estes modificado e não modificado resíduos de lisina e adjacentes polar aminoácidos, e com um segundo conservada lisina no lado oposto da membrana, enquanto que phosphatidyl lipídios foram atraídos pouco para esses sites . modos da figura de ligação da cardiolipina aos anéis C8 trimetilados. As α-hélices N E C-terminal das subunidades c são cinzentas e escuras, respectivamente. As moléculas de cardiolipina são verdes, com grupos de fosfato rosa. As esferas coloridas grandes representam as esferas de grãos grosseiros para aminoácidos específicos, como indicado, estando a uma distância de 0,7 nm das esferas de fosfato de cardiolipina. As partes a e B, a região de cardiolipina do grupo principal no folheto interno da membrana ligada, respectivamente, a duas subunidades c adjacentes (subunidades 8 e 1) e a uma subunidade c única; Parte C, uma molécula de cardiolipina do folheto externo da membrana ligada a uma subunidade c única.
no entanto, os tempos de residência das moléculas de cardiolipina com o anel foram breves, e suficientes para o rotor rodar apenas uma fracção de um grau na enzima activa. Com o anel c8 desmetilado e com anéis C10 e c11, a densidade das moléculas de cardiolipina ligadas neste local aumentou, mas os tempos de residência não foram muito alterados. Estas interações muito específicas, mas breves, com o anel-C rotativo são consistentes com funções funcionais para a cardiolipina na estabilização e lubrificação do rotor, e, interagindo com a enzima à entrada e saída do canal de protões transmembranares, na participação na translocação de protões através do domínio da membrana da enzima.
Filme de Simulação da interação de cardiolipina com o nativo de bovinos c8-ring. A espinha dorsal proteica é mostrada em cinza claro, com cadeias laterais de Lys-43 (vermelho), Gln-44 (amarelo), Gln-45 (azul) e Ser-48 (ciano) mostradas como esferas. As moléculas de cardiolipina são mostradas como varas verdes, com fosfatos como esferas rosa; as moléculas de POPC e POPE são mostradas como varas cinzentas escuras com fosfatos como esferas cinzentas escuras.