Po wprowadzeniu szczególnie neuroinwazyjnego i zjadliwego szczepu wirusa Zachodniego Nilu (WNV) do północno-wschodnich Stanów Zjednoczonych nastąpił dramatyczny wybuch śmiertelnych infekcji u ptaków, którym towarzyszyła znacznie mniejsza, ale niepokojąca liczba śmiertelnych infekcji u koni i ludzi.1,16,17,20,22 w ciągu 3 lat nowo wprowadzony wirus Flawirusa przetoczył się przez kontynent północnoamerykański, pozostawiając w jego ślady niezliczone tysiące martwych ptaków i tysiące potwierdzonych przypadków chorób, w tym setki ofiar śmiertelnych u koni i ludzi. Doniesienia o zachorowalności i śmiertelności u innych zwierząt domowych były mniej liczne. Przypadki ptaków i koni osiągnęły szczyt w Missisipi w 2002 roku.

na początku listopada 2002 roku, 2-letni, wysterylizowany Terier Maltański został przedstawiony skierowanemu weterynarzowi z ostrym początkiem epizodycznego, niekontrolowanego toczenia, które szybko rozwinęło się do drżenia całego ciała i ataksji. Początkowe leczenie doustnym fenobarbitalem i krótkim przebiegiem prednizonu dało minimalną poprawę. Po 1 tygodniu sprawa została skierowana do Animal Health Center, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University, MS. Badanie neurologiczne wykazało oznaki pląsawicy polegające na mimowolnych, nieregularnych, gwałtownych ruchach przypadkowych obejmujących całe ciało. Globusy oczne również wykazywały podobne nieregularne ruchy. Świadoma propriocepcja i skaczące reakcje były również łagodnie zmniejszone w przednich kończynach. Choroby powodujące mimowolne ruchy przypadkowe zwykle wpływają na obszary kory mózgowej lub specyficzne jądra pozapiramidowe telencefalonu lub pnia mózgu.Diagnostyka różnicowa obejmowała wieloogniskowe choroby zapalne-zakaźne, niezakaźne i immunologiczne. Morfologia krwi i chemioterapia w surowicy nie były widoczne, a analiza płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) nie wykazała istotnych nieprawidłowości. Elektroencefalogram ujawnił zmiany sugerujące zapalenie mózgu. Na podstawie objawów klinicznych i wyników elektroencefalogramu pies był leczony z powodu zakaźnych przyczyn zapalenia mózgu. Podczas hospitalizacji na oddziale intensywnej terapii pies stał się bardzo pobudliwy. Leczenie doksycykliną, klindamycyną, diazepamem, difenhydraminą i płynami nie zapobiegało zwiększaniu nasilenia ruchów mimowolnych i okresowych okresów hipertermii (do 108 F/42,2 C).

serologia dla Toxoplasma gondii, Neospora caninum (ProtaTek, Chandler, AZ), Ehrlichia canis i Rickettsia rickettsii (Antech, Southaven, MO) była ujemna i sparowane miana surowicy i płynu mózgowo-rdzeniowego dla wirusa nosówki psów i parwowirusa (Colorado Veterinary Diagnostic Laboratory, Ft. Collins, CO) wykazywał odporność ochronną, ale nie wykazał wytwarzania przeciwciał dooponowych. Po 6 dniach hospitalizacji i leczenia, około 2 tygodniach od wystąpienia objawów klinicznych, pies został poddany eutanazji z powodu pogarszającego się stanu.

badanie sekcji nie wykazało poważnych nieprawidłowości. Badanie mikroskopowe mózgu ujawnił łagodne, wieloogniskowe, nonsuppurative meningoencephalitis, które zaangażowane szarej istoty lub mieszanych szarych / białych obszarów materii, takich jak pnia mózgu. Charakteryzowały się one niewielkimi okołonaczyniowymi mankietami limfocytów w obrębie miąższu i czasami przyległych leptomenidów. Łagodna mikroglejoza neuropilu często towarzyszyła okołonaczyniowemu skuwaniu (rys. 1). Ogniska zapalenia, które czasami były obustronne, były obecne w płacie pyriform i związane z zakręt parahippocampal i hipokamp, pons i rdzeń i kory móżdżku. Unikalna zmiana w pobliżu linii środkowej raphe rdzenia na poziomie jąder oliwkowych składała się z obszaru martwicy z wysiękiem fibrynowym i krwotokiem, skupisk makrofagów (komórki gittera) i wielu spuchniętych aksonów (sferoidy) z kilkoma małymi mankietami limfocytowymi w pobliżu (Fig. 2). Sferoidy barwione dodatnio metodą Bielschowskiego na aksony.Jedyne inne istotne odkrycia ograniczały się do wątroby, która wykazywała niejednorodną indywidualizację hepatocytów, eozynofilii cytoplazmatycznej, pyknozy jądrowej i lizy hepatocytów (ostra rozproszona umiarkowana martwica wątroby), z licznymi hepatocytami dwujądrowymi i bez znaczącego nacieku komórek zapalnych. Liczne drożdże pączkujące z pseudohyphae (Candida sp.) były obecne w śluzie żołądka bez oznak inwazji śluzówki lub stanu zapalnego.

rys. 1. Cerebrum; pies. Rozproszone małe okołonaczyniowe mankiety jednojądrzastych komórek zapalnych i łagodna mikroglejoza w płacie piryform. Plami. Bar = 35 µm.

rys. 2. Medulla oblongata; pies. Obszar na linii środkowej raphe rdzenia ukazujący wiele spuchniętych aksonów (sferoidów) wskazywanych strzałkami, otaczający obszar martwicy z krwotokiem i makrofagami. Plami. Bar = 70 µm.

reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) dla WNV przeprowadzono na nieruchomym mózgu i niezmieszanym rdzeniu kręgowym, wątrobie i nerkach. Kawałki mózgu utrwalonego formaliną o masie 30-100 mg usunięto z rdzenia przedłużonego w pobliżu miejsca zmiany i różnych innych miejsc w pniu mózgu, korze mózgowej i móżdżku, przepłukano wodą i umieszczono w odczynniku rnalater™ (QIAgen, Valencia, CA) na co najmniej 1 godzinę przed ekstrakcją RNA. Próbki zamrożonego niezmieszanego rdzenia kręgowego, nerek i wątroby ekstrahowano bez wstępnego przetwarzania. Próbki tkanek zostały przerwane za pomocą tłuczka napędzanego silnikiem (PelletPestle, Kontes, Vineland, NJ), a RNA ekstrahowano za pomocą odczynnika Trizol™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) lub kolumn rnea-sy™ mini spin (QIAgen), zgodnie z instrukcjami producenta. Odwrotna transkryptaza-zagnieżdżona-reakcja łańcuchowa polimerazy (rtnPCR) została przeprowadzona przy użyciu zagnieżdżonych starterów i modyfikacji metody opisanej przez Johnsona i wsp., 12 z zestawami odczynników komercyjnych (OneStep™ RT PCR, Qiagen, Valencia, CA i Taq SuperPak™, Sigma, St. Louis, MO). Kontrola pozytywna była 1 : 1000 rozcieńczeń łącznego RNA wyekstrahowanego z niezmieszanych WNV-dodatnich tkanek ptaków (głównie nerek i mózgu). Pasma DNA zostały wykryte po elektroforezie żelu agarozowego przy użyciu GelStar (Cambrex, East Rutherford, NJ). Trzy z pięciu kawałków formaliny-fixed medulla były dodatnie na rtnPCR, podczas gdy wszystkie inne okazy nieruchomego mózgu (kora mózgowa, móżdżek i pień mózgu) i niezmieszanego (zamrożonego) rdzenia kręgowego, nerki i wątroby były ujemne.

Immunohistochemię (IHC) przeprowadzono w celu wykazania antygenu WNV. Sekcje tkanek utrwalonych formaliną, osadzonych parafiną (FFPE) przecięto w temperaturze 5 µm i zabarwiono za pomocą autostainera (DAKO, Carpinteria, CA) i paczkowanych odczynników do wykrywania peroksydazy streptawidyny–biotyny–chrzanu (LSAB2, DAKO), zgodnie z instrukcjami producenta. Fragmenty mózgu, nerek, trzustki, wątroby, serca, śledziony, nadnerczy i języka zostały zabarwione przy użyciu mysich poliklonalnych przeciwciał przeciw WNV (VR-1267-AF, ATCC, Manassas, VA) po wstępnej obróbce proteinazą K (Dako). To przeciwciało poliklonalne wykazało umiarkowane rozproszone zabarwienie tła we wszystkich tkankach, co komplikuje interpretację. Nie zaobserwowano specyficznego zabarwienia, z wyjątkiem mózgu, w którym neurony dyfuzyjnie wykazywały jednolite, lekkie zabarwienie cytoplazmatyczne w porównaniu ze szkiełkami kontrolnymi zabarwionymi nieistotną monoklonalną IgG1. Wyniki uznano za niejednoznaczne ze względu na wysokie zabarwienie tła i rozproszony charakter zabarwienia neuronów, z niewielkimi zmianami intensywności. Wyniki te sugerowały niedobór antygenu w mózgu psa, w porównaniu z zakażonymi tkankami ptaków, gdzie obserwowano silne zabarwienie cytoplazmatyczne.

sekcje mózgu zostały również zabarwione przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przeciwko nukleoproteinie wirusa nosówki psów (CDV-NP, Vmrd, Pullman, WA), z wynikiem negatywnym. IHC na mózgu FFPE dla wirusa wścieklizny przeprowadzono w innym laboratorium (Prairie Diagnostic Service, Saskatoon, SK, Kanada), z wynikiem ujemnym.

chociaż śmiertelne zapalenie mózgu spowodowane WNV jest dobrze udokumentowane u wielu gatunków ptaków,22 koni,8 i ludzi,20 klinicznych objawów choroby wywołanej tym wirusem rzadko udokumentowano u psów. W obszarach, gdzie WNV jest endemiczny, wysoka częstość występowania specyficznych przeciwciał neutralizujących wskazuje, że zakażenie u psów jest powszechne, nawet jeśli choroba kliniczna nie jest. Jeden serosurvey z RPA, gdzie WNV jest endemiczny, wykazały 37% psów miał przeciwciała neutralizujące WNV.5 serosurvey w Nowym Jorku, bezpośrednio po pierwszej identyfikacji WNV na półkuli zachodniej, wykazały, że wyższy odsetek psów (10%) niż konie (3%) lub ludzi (2,5%) miał specyficzne przeciwciała neutralizujące w pobliżu epicentrum wybuchu (Queens).15 w poprzednim raporcie z RPA opisano izolację wirusa, później zidentyfikowanego jako WNV, z mózgu psa z ciężkimi objawami klinicznymi zapalenia mózgu.7,21 w jednym eksperymencie zakażenie trzech psów WNV wywołało bezobjawową serokonwersję we wszystkich trzech, ale mierzalną wiremię tylko u jednego z tych zwierząt, co później okazało się cierpieć na hiperadrenokortycyzm.5 nowsze badanie z użyciem szczepu amerykańskiego wykazało niski poziom wiremii u wszystkich czterech psów i ośmiu kotów zakażonych, 2 bez objawów klinicznych u psów i tylko łagodną, przejściową gorączką u kotów.

opublikowano dwa współczesne doniesienia o ciężkiej infekcji WNV u psów w USA. Buckweitz et al. opisano pośmiertne dowody replikacji WNV w wielu tkankach 11-letniego, mężczyzny, psa rasy mieszanej z chorobą nerek i ośrodkowego układu nerwowego (OUN); ilościowa reakcja łańcuchowa odwrotnej transkryptazy–polimerazy (RT-PCR) wykazała, że sekwencje wirusowe były najbardziej obfite w nerkach, a następnie w sercu, mózgu, płucach i śledzionie.6 Lichtensteiger et al. opisz pośmiertne ustalenia po eutanazji 8-letniego, mieszanego psa z ciężką chorobą somatyczną, która obejmowała zapalenie mięśnia sercowego, a także śmiertelne zapalenie mózgu WNV U 3-miesięcznego wilczego szczeniaka.Oba te doniesienia dokumentowały sekwencje antygenowe i genetyczne WNV, stosując odpowiednio IHC i RT-PCR, w wielu tkankach pozanuralnych związanych ze zmianami martwicy i stanu zapalnego.

Ten raport dokumentuje przypadek ciężkiej choroby neurologicznej u młodego dorosłego psa z trwającymi 2 tygodnie objawami OUN, w którym dowody zakażenia WNV były ograniczone do mózgu. Zmiany histologiczne w mózgu były niespecyficzne, ale zgodne z wynikami WNV encephalitis zgłaszanymi u koni, 8 ludzi, 20 oraz w dwóch raportach u psów, 6,18, zarówno w odniesieniu do lokalizacji (pnia mózgu i rdzenia), jak i typu (nie ropiące zapalenie mózgu z obszarami martwicy). Kliniczne objawy utraty równowagi (toczenia) i ataksji byłyby zgodne z chorobą móżdżku, podczas gdy drżenia całego ciała sugerują bardziej rozproszone zaburzenia mózgu. Dowody na zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych znaleziono w płacie pyriform i hipokampie, pnia mózgu i móżdżku / rdzenia, ale oszczędził wiele prosencefalon. Martwica wątroby w tym przypadku bez dowodów miejscowej replikacji wirusa (ujemny wynik PCR i IHC) była prawdopodobnie spowodowana ciężką nawracającą hipertermią. Nie można wykluczyć uszkodzenia wątroby spowodowanego wcześniejszą replikacją wirusa, które ustąpiło podczas choroby, chociaż nie stwierdzono zapalenia. Liczne hepatocyty dwujądrowe sugerowały podostre uszkodzenia z regeneracją. Obecność drożdży Candida w żołądku uznano za przypadkowe odkrycie związane z leczeniem antybiotykami. Kontrastujące z ustaleniami Buckweitz et al.6 oraz Lichtensteiger et al., 18 nie wykryto żadnych zmian, wirusowych kwasów nukleinowych ani antygenu wirusowego w tkankach pozanuralnych, w tym zamrożonych i utrwalonych nerkach i wątrobie tego psa.

obszar martwicy znaleziony w pniu mózgu tego psa był związany z miejscową odpowiedzią makrofagową (komórki gittera), ale nie jawnym miejscowym naciekiem zapalnym sugerującym,jak opisano u koni 8, że zmiana może mieć etiologię naczyniową lub ewentualnie immunologiczną, a nie bezpośrednią etiologię cytolityczną lub zapalną. IHC dla WNV w mózgu nie był w stanie przekonująco wykazać antygenu wirusowego w tym przypadku i w przypadku opisanym przez Buckweitza i wsp., 6 wskazuje na niższy poziom replikacji wirusa niż obserwowany w tkankach ptaków, podobnie jak u koni.12 Lichtensteiger et al.18 nie zgłaszało IHC mózgu.

stosunkowo wyższy wskaźnik chorób neurologicznych obserwowany w zakażeniach koni z amerykańskim szczepem WNV w porównaniu z tymi we Włochach8 jest poparty badaniami eksperymentalnymi na myszach, które wskazują, że amerykański szczep jest wysoce neuroinwazyjny w porównaniu z innymi szczepami.3 dodatkowe badania na myszach wykazały,że ekspozycja na gazowe środki znieczulające i CO2 zwiększa neuroinwazję WNV w sposób zależny od stężenia i czasu,4, 13 sugerując, że inne czynniki środowiskowe lub gospodarza mogą wpływać na rozwój choroby neurologicznej u zwierząt. Niska częstość występowania klinicznych chorób u psów w obliczu wysokiej seroprevalence sugeruje, że psy są bardziej odporne na neuroinwazję niż ludzie lub konie.

nie znaleziono dowodów na zakażenie pozatwardówkowe u koni z zapaleniem mózgu i rdzenia WNV8, tak jak u tego psa. Być może u tego teriera Maltańskiego odpowiedź immunologiczna oczyściła wirusa z tkanek pozanuralnych. Obecność obfitej replikacji wirusa w tkankach zewnątrzoponowych w dwóch innych doniesieniach nas infekcji psów sugeruje, że niektóre wirusowe replikacji występuje w tkankach zewnątrzoponowych przed neuroinwazją i że nerki i serce są prawdopodobnie tkanki docelowe u psa. Buckweitz et al.6 sugerują biopsję nerek w diagnostyce zakażenia WNV u psów, ale Lichtensteiger et al.18 nie znaleziono antygenu wirusowego w nerce badanego psa. Wartość kliniczna biopsji nerkowej18, a nawet badania moczu na obecność WNV, prawdopodobnie przy użyciu RT-PCR, nie została jeszcze krytycznie oceniona.

Pozaneuralna replikacja WNV u ludzi może być ekstrapolowana na podstawie doniesień o śmiertelnym zapaleniu mózgu u biorców nerek od zakażonych dawców,które rozpoczęło się 13-18 dni po transplantacji i ciężkim zapaleniu mózgu u biorcy serca,9, 11 wskazujących, że choroba może być przenoszona przez przeszczep krwi lub narządów. Dalsze dowody silnej replikacji WNV w tkankach zewnątrzoponowych ssaków przedstawiono w niedawnym raporcie dokumentującym śmiertelne zakażenie WNV u trzech wiewiórek lisów Wschodnich, z dowodami replikacji wirusa nerkowego, mózgowego, sercowego, wątrobowego i płucnego.14 dodatkowe badania są potrzebne do wyjaśnienia szczegółów Biologii i patofizjologii infekcji WNV u ssaków.

dalsze znaczenie WNV dla zdrowia zwierząt i ludzi w tym kraju prawdopodobnie będzie wiązało się z tym, że wirus stanie się endemiczny z sporadycznymi ogniskami. Agencje zdrowia publicznego często dostarczają aktualnych informacji na temat ognisk chorób ludzkich. Możliwe, że analiza przeciwciał przeciw WNV w surowicach psów i kotów może dostarczyć cennych informacji epidemiologicznych na temat rozprzestrzeniania się i częstości występowania WNV.