rotacja napędzana hydrolizą ATP

hydrolityczny cykl obrotowy składa się z trzech etapów 120o w katalitycznej domenie F1 enzymu, zdefiniowanej w biofizycznych doświadczeniach rotacyjnych przez „katalityczne mieszka” . Każdy etap 120o jest podzielony na podetapy określone przez katalityczne mieszkanie po każdym kroku 120o, z interweniującym „wiązaniem ATP” mieszka w 30o i „uwalnianiem fosforanu” mieszka w 95o. Uwalnianie fosforanu pozwala enzymowi ukończyć etap 120o i osiągnąć rozkład wiązania ATP. Opisaliśmy struktury domeny katalitycznej F1 przy uwalnianiu fosforanu i dwudyciu katalitycznym i wykazaliśmy, że podst .rotacyjny 35o między uwalnianiem fosforanu a dwudyciem katalitycznym zależy od uwolnienia fosforanu z „wiązania ATP”, co następnie pozwala enzymowi przejść do „dwudycia katalitycznego”. Samo katalityczne mieszkanie stanowi przejście, w którym związana cząsteczka ATP staje się gotowa do hydrolizy. Teraz nasze wysiłki koncentrują się wokół definicji katalitycznej zamieszkują encefalopatii w F1-ATPazy.

Generowanie wideo z 30о obrotów γ-aktyny w encefalopatią w F1-Atpazy poprzez uwalnianie fosforanów z obliczonej dziedzinie-aktyny. Film rozpoczyna się widokiem od strony F1-Tiopu w przedstawieniu wstążkowym, z oprawionym tiofosforanem jako pomarańczowymi kulkami. Podjednostki α i β są odpowiednio czerwone i żółte. Następnie podjednostki aTP-, aDP-, ßTP – i ßDP są usuwane kolejno, pozostawiając dimer AE-dimer i podjednostki γ, δ i ε (odpowiednio niebieski, magenta i zielony). Ten pozostały subkompleks jest obrócony w prawo wokół osi y o 100°, aby odsłonić widok z boku podjednostki aE i środkowej łodygi. Następnie usuwa się podjednostki δ i ε oraz reszty γ – 42-210, a podjednostka ßE staje się słabsza. W końcowych klatkach związany fosforan jest uwalniany, a podjednostka AE otwiera się i oddala od podjednostki γ, zakłócając interakcje między podjednostkami AE i γ. W celu przywrócenia tych oddziaływań podjednostka γ obraca się o 30°. Struktura stanu końcowego to stan po-fosforanowy bydlęcej F1-ATPazy występujący w F1-I3-Tiopie.

rotacja napędzana przez pmf

kluczowym brakującym punktem odniesienia do zrozumienia generowania rotacji z pmf jest szczegółowa struktura na poziomie atomowym szlaku, który protony przyjmują przez domenę membranową enzymu. Najlepszą dostępną do tej pory strukturą jest ta, którą ustaliliśmy w rozdzielczości 4 Å w 2015 r. za pomocą rentgenowskiej krystalografii kompleksu enzymatycznego z Paracoccus denitrificans . Pozostałe oznaczono w 2015 i 2016 mikroskopem krioelektronowym pojedynczych cząstek enzymów bydlęcych i grzybiczych, w najlepszym przypadku O Rozdzielczości 6 Å. Jednak wszystkie te modele nie zawierają szczegółów wymaganych do sformułowania molekularnego mechanizmu generowania ruchu rotacyjnego z siły napędowej protonu, a ze względu na ruchliwość i elastyczność enzymów pojedyncze cząstki enzymu mogą przyjmować wiele różnych pozycji. W związku z tym stanowi niezwykle trudny problem dla podejścia cryo-em.

Oblicz domenę membranową F-ATPazy z P. angusta. W A-D podjednostka a jest niebieska. A i B, widoki w postaci stałej z boku i poniżej domeny membranowej. Pierścień c10 jest szary, podjednostka b (górna część nie jest pokazana) jest różowa, a jasnożółte, ceglastoczerwone, jasnoszare i beżowe segmenty to transmembrane α-helisy, Ch1-Ch4 przypisane do podjednostki f, ATP8, aH1 i bH1, odpowiednio. W pierścieniu c, I-IV wskazują cztery transmembrane C-końcowe α-helisy w kontakcie z podjednostką a. C I D, widoki podjednostki a w reprezentacji stałej i kreskówki oglądane z zewnątrz i patrząc z interfejsu z pierścieniem c, odpowiednio, z aH1 w bladym kolorze cyjanowym. Zachowane reszty polarne są żółte, pozycje mutacji ludzkich związanych z patologiami (patrz tabela S1) są czerwone. Różowa kula oznacza zachowany Arg – 179 w aH5, który jest niezbędny do translokacji protonów. Dolna strzałka wskazuje drogę wlotową dla protonów, które przenoszą się do Glu-59 w końcówce α-helisy-II pierścienia C. Są one noszone wokół pierścienia w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, jak widać z góry, aż dotrą do Arg-179, gdzie wejdą do ścieżki wyjścia, oznaczonej górną strzałką.

struktury bakteryjnych syntaz ATP

rysunek bakteryjne syntazy ATP. A) F1-Atpaza z Caldalkalibacillus thermarum w rozdzielczości 2,6 Å przez krystalografię rentgenowską; B) enzym syntazy ATP z paracoccus denitrificans w rozdzielczości 4 Å przez krystalografię rentgenowską; C) syntaza ATP z Escherichia coli w rozdzielczości 7 Å przez cryo-em.

w stosunku do szeroko zakrojonych badań, które przeprowadziliśmy na enzymach mitochondrialnych, struktury bakteryjnych syntaz ATP były mało badane, z wyjątkiem struktur katalitycznych domen F1 enzymów z Escherichia coli i Geobacillus stearothermophilus (dawniej Bacillus stearothermophilus) w rozdzielczości 3,2 i 3,9 Å, odpowiednio, oraz struktur pierścieni c z ich domen błonowych z różnych gatunków . Aby wypełnić tę lukę, do tej pory opracowaliśmy strukturę całego enzymu z paracoccus denitrificans w rozdzielczości 4 Å, a także, we współpracy z profesorem G. M. Cookiem i współpracownikami z Dunedin w Nowej Zelandii, struktury domen katalitycznych F1 syntaz ATP z Caldalkalibacillus thermarum, Fusobacterium nucleatum i Mycobacterium smegmatis. C. thermarum jest termoalkalifilem, a struktura jego domeny katalitycznej w rozdzielczości 2,6 Å jest najdokładniejszą strukturą bakteryjnej F1-ATPazy, jak dotąd ustaloną . Enzym z M. smegmatis jest blisko spokrewniony z enzymem M. tuberculosis. Struktura jego domeny katalitycznej została ustalona na 4 Å i stanowi cel rozwoju nowych leków przeciwprątkowych . Oportunistyczny patogen przyzębia, Fusobacterium nucleatum, jest związany z szeroką gamą chorób, w tym infekcjami jamy ustnej, zaawansowanymi wynikami ciąży, chorobami przewodu pokarmowego i miażdżycą tętnic. Ponadto, jest to związane z rozwojem i progresją raka jelita grubego poprzez hamowanie przeciwnowotworowych szlaków sygnalizacji immunologicznej i późniejsze promowanie oporności chemicznej. Jest to beztlenowiec obligatoryjny i łączy wolną energię dekarboksylacji glutakonylo-CoA z krotonylo-CoA w transport jonów Na+ przez błonę komórkową w celu wytworzenia siły napędowej jonu sodu (smf). Syntaza ATP wykorzystuje smf do kierowania syntezą ATP wymaganą do reakcji katabolicznych i anabolicznych. Strukturę jej domeny katalitycznej F1 określono w rozdzielczości 3,6 Å. Wykorzystując cryo-EM, opublikowano mapę nienaruszonej syntazy ATP E. coli pokazującą podjednostkę ε w pozycji ” up „(patrz poniżej), a ostatnio określono strukturę syntazy ATP z geobacillus stearothermophilus na 3 Å.

struktura syntaz ATP pasożytów

rysunek F1-ATPazy z Trypanosoma brucei. Podjednostki α-, β-, γ-, δ-, ε-i P18 są odpowiednio czerwone, żółte, niebieskie, zielone, magenta i cyjan. (A i B) kreskówkowe reprezentacje widoku bocznego i górnego; (C-E) reprezentacje powierzchni (C), bydlęcego F1-ATPase, (D), T. enzym brucei w kolorze szarym z usuniętym p18 i kolorowe sekcje pokazujące aminokwasy dodatkowe do enzymu bydlęcego oraz (E) enzym T. brucei z obecnym p18.

struktury i funkcje składników syntaz ATP, zwłaszcza tych podjednostek zaangażowanych bezpośrednio w katalityczne tworzenie ATP, są szeroko zachowane w metazoanach, grzybach, eubakterii i chloroplastach roślinnych. Na podstawie mapy na 32.5 Å rozdzielczość określona in situ w mitochondriach euglenozoan pasożyta, Trypanosoma brucei, za pomocą kriotografii elektronowej, zaproponowano, że syntaza ATP u tego gatunku ma niekanoniczną strukturę z różnymi miejscami katalitycznymi, gdzie katalitycznie niezbędny palec argininy jest dostarczany, nie przez podjednostkę α przylegającą do miejsca wiązania katalitycznego nukleotydu, jak u wszystkich badanych gatunków, ale przez białko zwane p18 występujące tylko w euglenozoa . We współpracy z dr Aleną Zíkovą i Ondřejem Gahurą z Instytutu Parazytologii w Czeskich Budziejowicach w Republice Czeskiej scharakteryzowaliśmy F1-Atpazę T. brucei i określiliśmy strukturę krystaliczną enzymu w rozdzielczości 3,2 Å. Ta struktura pokazuje, że propozycja, że domena katalityczna tej syntazy ATP ma strukturę niekanoniczną i różne miejsca katalityczne jest nieprawidłowa. Pod wieloma względami struktura F1-ATPazy T. brucei jest blisko podobna do struktury F1-ATPazy oznaczonej wcześniej. Α3β3-sferyczna część domeny katalitycznej, gdzie znajdują się trzy miejsca katalityczne, plus Centralna łodyga, są silnie zachowane, a palec argininy jest dostarczany konwencjonalnie przez podjednostki α sąsiadujące z każdym z trzech miejsc katalitycznych znajdujących się w podjednostkach β. Tak więc enzym ma konwencjonalny mechanizm katalityczny. Struktura różni się od wcześniejszych posiadaniem podjednostki p18, zidentyfikowanej tylko u euglenozoa, związanej z zewnętrzną powierzchnią każdej z trzech podjednostek α, tworząc w ten sposób domenę F1. Podjednostka p18 jest białkiem pentatricopeptide repeat (PPR) z trzema PPR i wydaje się nie działać w mechanizmie katalitycznym enzymu. T. brucei jest czynnikiem sprawczym choroby nasennej u ludzi i chorób pokrewnych u zwierząt domowych żyjących w Afryce Subsaharyjskiej, a struktura jego F1-ATPazy stanowi cel dla rozwoju nowych leków do leczenia choroby.

rola kardiolipiny

anionowa kardiolipina lipidowa jest niezbędnym składnikiem aktywnych syntaz ATP. U metazoanów ich wirniki zawierają pierścień ośmiu podjednostek c składających się odpowiednio z wewnętrznych i zewnętrznych okręgów N – I C-końcowych α-Helis. Początek C-końcowej α-helisy zawiera ściśle zachowaną i całkowicie trimetylowaną pozostałość lizyny w regionie lipidowej grupy głowy błony. Większe pierścienie o znanej strukturze, od c9 – C15 w eubakterii i chloroplastach, zachowują pozostałości lizyny lub argininy w równoważnej pozycji. W symulacjach komputerowych uwodnionych membran zawierających trimetylowane lub niemetylowane bydlęce pierścienie c8 i bakteryjne pierścienie C10 lub c11, grupy główkowe cząsteczek kardiolipiny wiązały się selektywnie z tymi zmodyfikowanymi i niezmodyfikowanymi resztami lizyny i z przyległymi aminokwasami polarnymi oraz z drugą konserwowaną lizyną po przeciwnej stronie błony, podczas gdy lipidy fosfatydylowe były przyciągane w niewielkim stopniu do tych miejsc .

rysunek tryby wiązania kardiolipiny z trimetylowanymi pierścieniami c8. N-I C-końcowe α-helisy podjednostek c są odpowiednio ciemne i jasnoszare. Cząsteczki kardiolipiny są zielone, z różowymi grupami fosforanowymi. Duże kolorowe kulki reprezentują gruboziarniste kulki dla określonych aminokwasów, jak wskazano, leżące w odległości 0,7 nm od fosforanowych kulek kardiolipiny. Część A i B, obszar grupy głównej kardiolipiny w wewnętrznej części błony związanej, odpowiednio, z dwiema sąsiadującymi podjednostkami c (podjednostki 8 i 1) oraz z pojedynczą podjednostką c; część C, cząsteczka kardiolipiny w zewnętrznej części błony związanej z pojedynczą podjednostką C.

jednak czasy przebywania cząsteczek kardiolipiny z pierścieniem były krótkie i wystarczające, aby wirnik obracał tylko ułamek stopnia w aktywnym enzymie. W przypadku demetylowanego pierścienia c8 i pierścieni C10 i c11 gęstość wiązanych cząsteczek kardiolipiny w tym miejscu wzrosła, ale czasy przebywania nie uległy znacznej zmianie. Te wysoce specyficzne, ale krótkie interakcje z obracającym się pierścieniem c są zgodne z funkcyjnymi rolami kardiolipiny w stabilizowaniu i smarowaniu wirnika oraz, poprzez interakcję z enzymem na wlocie i wyjściu z kanału protonowego przezbłonowego, w udziale w translokacji protonu przez domenę membranową enzymu.