opis i Uwagi ogólne

endonukleazy restrykcyjne (REs) to enzymy bakteryjne, które rozszczepiają dwuniciowe DNA. Re typu I są ważne w funkcji bakterii, ale nie rozszczepiają DNA w określonych sekwencjach. Res typu II, opisane do zastosowania w niniejszym podręczniku, wymagają wysoce specyficznych miejsc rozszczepiania DNA i dlatego są niezwykle użytecznymi narzędziami w biologii molekularnej. Enzymy te umożliwiają klonowanie i oczyszczanie określonych fragmentów DNA. 500 lub tak znane REs są zazwyczaj izolowane z różnych szczepów bakterii.

REs są obecne w bakteriach prawdopodobnie do niszczenia DNA z obcych źródeł (np. infekowanie bakteriofagów) poprzez rozszczepianie obcego DNA w określonych miejscach rozpoznawania. DNA bakterii gospodarza jest chronione przed rozszczepianiem, ponieważ specyficzne miejsca rozpoznawania są modyfikowane, zwykle przez metylację w jednej z zasad w miejscu, dzięki czemu miejsce to nie jest już substratem do ponownego rozszczepiania. Praktycznie REs o różnej specyficzności miejsca rozpoznania zostały oczyszczone z różnych szczepów bakterii i są wykorzystywane przez biologów molekularnych w określonych warunkach do rozszczepiania oczyszczonego DNA ze źródeł eukariotycznych na określone fragmenty w reakcji in vitro. Bakterie gospodarza używane do rozmnażania klonowanego DNA w laboratorium są zwykle zmutowane w genach restrykcyjnych gospodarza (hsdR, hsdM lub HSDD); tak więc ich wewnątrzkomórkowa aktywność enzymu nie zniszczy obcych sekwencji rekombinowanych.

te końce są komplementarne („lepkie”) i mogą być enzymatycznie przyłączone do dowolnego innego Termini generowanego przez ecori za pomocą ligazy dna T4. Inne Re rozpoznają różne sekwencje i tworzą unikalne rozszczepienia, w wyniku których powstają inne zdefiniowane końce, z których niektóre mają również 5 'wystające końce, 3′ wystające końce lub brak wystających (tępych) końców (patrz tabela 5.1). Każdy RE ma określoną sekwencję i liczbę nukleotydów wymaganych do utworzenia miejsca rozpoznania. Niektóre REs nie wymagają specyficznego nukleotydu w każdej pozycji miejsca rozpoznania. Na przykład, w niektórych przypadkach wystarczy nukleotyd purynowy (a lub G) w określonej pozycji. Częstotliwość, z jaką RE będzie ciąć DNA, jest zatem związana z liczbą zasad w sekwencjach rozpoznawania (jeśli wymagana jest większa liczba zasad, mniej cięć można wykonać) i konkretnymi zasadami W dowolnej pozycji.

REs są użyteczne, ponieważ ich specyficzność i wynikający z tego ligatable termini pozwalają na rozwarstwienie, analizę i restrukturyzację DNA w kontrolowany, przewidywalny, specyficzny dla miejsca sposób. Ponieważ są enzymami, każdy z nich ma specyficzne wymagania dotyczące warunków prowadzących do optymalnej aktywności rozszczepiania. Na szczęście wiele z nich jest aktywnych w podobnych warunkach, przy czym podstawową zmienną jest siła jonowa (np. NaCl w buforze). Praktyczne warunki zostały empirycznie określone dla wykorzystania każdego RE jako narzędzia badawczego.

ilość aktywności RE zwykle nie jest definiowana za pomocą klasycznej kinetyki enzymatycznej. Raczej aktywność RE jest zdefiniowana w praktycznych terminach do użytku w laboratorium. Jedną jednostkę (U) aktywności dla RE definiuje się zwykle jako ilość enzymu, która wytnie 1 µg we wszystkich określonych miejscach w próbce DNA (Zwykle bakteriofag λ) w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C. Rzeczywista osiągnięta aktywność może być inna, jeśli obecne są dodatkowe miejsca trawienia. Na przykład, jeśli 1 U RE wystarcza do całkowitego wycięcia 1 µg bakteriofagowego DNA λ w jednym miejscu w standardowych warunkach testowych, może nie być w stanie wyciąć całkowicie 1 µg próbki DNA, która ma cztery miejsca dla RE, lub próbki, która nie została wystarczająco oczyszczona.

inne czynniki dotyczące warunków reakcji również wpływają na aktywność RE. Należą do nich czystość DNA, bufor, warunki temperaturowe i sam RE. Metylacja DNA, wiązanie białka lub nadmierna lepkość DNA o dużej masie cząsteczkowej W lepkich roztworach mogą zmniejszać skuteczność ponownego trawienia. DNA, które ma być wycięte, powinno być zwykle wolne od zanieczyszczeń; ekstrakcja SS-fenol/chloroform i wytrącanie etanolu (sekcja 20-1) usunie wiele przeszkadzających zanieczyszczeń. W przeciwieństwie do tego, większość REs zazwyczaj nie ma negatywnego wpływu na RNA lub jednoniciowe DNA. Tak więc dodanie tRNA jako koprecypitantu może być użyteczne w odzyskiwaniu małych ilości DNA bez wpływu na późniejsze ponowne trawienie.

typowy warunek testu reakcji RE zawiera bufor (10 mM Tris, pH 7,4 jest powszechne), 10 mM Mg2+ i jest wolny od znacznych stężeń czynników chelatujących (bufor TE zawiera wystarczająco małą ilość EDTA). Bufory RE zawierają również odpowiednie stężenia soli, aby zapewnić optymalną siłę jonową dla każdego RE. W niektórych przypadkach dodaje się BSA, DTT i spermidynę, aby zapewnić optymalną aktywność enzymu. Cztery ogólne bufory RE mogą spełniać wymagania dla większości OZE, a wcześniejsze przygotowanie 10 × zapasów tych buforów jest opisane poniżej. Większość ponownych fermentacji odbywa się w temperaturze 37°C, chociaż istnieje kilka wyjątków, takich jak TaqI.

większość zakupionych REs jest dostarczana z odpowiednim buforem do przechowywania, ale ten zawiera 25-50% glicerolu, aby zapobiec zamarzaniu podczas przechowywania w temperaturze -20°C. stężenia glicerolu powyżej 5% (obj./obj.) w testach trawienia RE mogą hamować aktywność wielu REs. ponadto wysokie stężenia glicerolu podczas trawienia RE mogą rozluźnić specyficzność sekwencji niektórych REs, powodując fałszywe rozszczepienia. Na przykład zjawisko to obserwuje się przy powszechnie używanym RE EcoRI, gdzie obserwowana w pewnych warunkach aktywność nosi nazwę ecori * (gwiazda). Z tych powodów ważne jest, aby objętość reakcji trawienia RE była wystarczająco duża, aby objąć co najmniej rozcieńczenie 1:10 samego RE (i w ten sposób zmniejszyć stężenie glicerolu). Inne czynniki, takie jak pH, etanol lub niewłaściwe stężenie soli, mogą również powodować aktywność gwiazdy lub zmniejszoną aktywność; dlatego ważne jest staranne przestrzeganie zalecanych warunków.

kilka innych kwestii jest przydatnych przy użyciu REs. używaj nowej końcówki pipety za każdym razem, gdy RE jest przenoszony. Śladowe ilości zanieczyszczeń dodane do zasobu RE mogą zapobiec jego dalszemu wykorzystaniu i zakłócać wyniki uzyskane w kolejnych eksperymentach. Podczas optymalizacji reakcji lepiej jest dodać dodatkowe RE niż inkubować przez znacznie dłużej niż 1 godzinę. Ponadto, jak wspomniano powyżej, aktywność enzymu jest zdefiniowana tylko dla cięcia standardu DNA. Ponieważ próbka jest na ogół bardzo różni się od normy, dobrym przewodnikiem jest użycie około 2-3 U RE na mikrogram DNA do cięcia, zwłaszcza przy próbie trawienia trudnej próbki. Czasami może być konieczne miareczkowanie ilości RE potrzebnej do odpowiedniego trawienia próbki DNA.

wreszcie, jeśli mają być stosowane dwa OZE, należy zwrócić uwagę na optymalne warunki solne każdego z nich. Jeśli oba wymagają tego samego bufora, trawienie może odbywać się jednocześnie lub sekwencyjnie. Jeśli wymagane są różne warunki solne, należy najpierw użyć ponownie wymagającego mniejszej ilości soli. Po inkubacji dostosować stan soli i trawić z RE wymagających wysokiej soli. Aktywność RE może być usunięta przez SS-fenol/chloroform ekstrakcji we wszystkich przypadkach. Niektóre OZE są termolabilne i mogą być inaktywowane przez ogrzewanie do 70°C przez 5 minut. Ta właściwość różni się jednak od jednego RE do następnego i powinna być weryfikowana dla każdego użytego RE.