Rotasjon drevet AV ATP hydrolyse

den hydrolytiske rotasjonssyklusen består av tre 120o-trinn i enzymets katalytiske F1-domene, definert i biofysiske rotasjonseksperimenter av «katalytisk bolig». Hvert 120o-trinn er delt inn i deltrinn definert av en katalytisk dvel etter hvert 120o-trinn, med en mellomliggende «ATP-binding» dvel ved 30o og en» fosfatfrigivelse » dvel ved 95o. Frigivelse av fosfat gjør at enzymet kan fullføre 120o-trinnet og komme frem TIL ATP-bindingsboligen. Vi har beskrevet strukturer Av F1-katalytisk domene ved fosfatfrigivelse og katalytisk bor, og har vist at 35o roterende sub-trinn mellom fosfatfrigivelse og katalytisk bor, avhenger av frigjøring av fosfat fra «ATP-binding» – dvelen, som deretter tillater enzymet å fortsette til «katalytisk dvel» . Den katalytiske boringen representerer en overgang hvor et bundet ATP-molekyl blir klar for hydrolyse. Vår nåværende innsats er sentrert rundt å definere katalytisk dvel i encefalopati F1-ATPase.

– >

Filmen Generasjon av 30o rotasjon av γ-subunit i encefalopati F1-ATPase ved frigivelse av fosfat fra ßE-subunit. Filmen starter med utsikt fra Siden Av F1-Tiop i båndrepresentasjon, med bundet tiofosfat som oransje sfærer. Α – og β-underenhetene er henholdsvis røde og gule. Så, aTP-, aDP-, ßTP – og ßDP-underenhetene er fjernet sekvensielt forlater aEßE-dimer og den sentrale stilken underenhetene γ, δ og ε (blå, magenta og grønn, henholdsvis). Dette restkomplekset dreies til høyre rundt y-aksen med 100° for å vise sidevisning av aE-underenheten og sentralstammen. Da fjernes δ – og ε-underenhetene og resterne γ-42-210, og ß blir svakere. I de endelige rammene frigjøres det bundne fosfatet og aE-underenheten åpnes og beveger seg bort fra γ-underenheten, noe som forstyrrer pakningsinteraksjonene mellom aE – og γ-underenhetene. For å gjenopprette disse interaksjonene roterer γ-underenheten med 30°. Strukturen til den endelige tilstanden er postfosfatfrigjøringstilstanden for bovin F1-ATPase funnet I F1-I3-Tiop.

Rotasjon drevet av pmf

nøkkelen mangler datum for å forstå genereringen av rotasjon fra pmf er den detaljerte strukturen på atomnivå av banen protonene tar gjennom membrandomenet til enzymet. Den beste tilgjengelige strukturen til dags dato er den som vi bestemte oss for ved 4 Å oppløsning i 2015 Ved røntgenkrystallografi av enzymkomplekset Fra Paracoccus denitrificans . Andre ble bestemt i 2015 og 2016 ved kryo-elektronmikroskopi av enkeltpartikler av storfe – og soppenzymer, i beste fall ved 6 Å oppløsning . Imidlertid mangler disse modellene alle detaljene som kreves for formulering av en molekylær mekanisme for generering av rotasjon fra protonmotivkraften, og på grunn av enzymets motilitet og fleksibilitet kan enkeltpartikler av enzymet vedta mange forskjellige posisjoner. Derfor presenterer det et uvanlig vanskelig problem for cryo-em-tilnærmingen.

Figur membrandomenet Til F – atpasen fra P. angusta. I A-D er a-underenheten kornblomst blå. A og B, visninger i solid representasjon fra siden, og under membran domenet. C10-ringen er grå, b-underenheten (øvre del ikke vist) er rosa, og de lysegule, mursteinrøde, lyse cyan-og beige segmentene er transmembrane α, Ch1-Ch4 tilordnet henholdsvis underenheten f, ATP8, aH1 og bH1. I c-ringen indikerer I-IV de fire transmembrane C-terminale α-helices i kontakt med underenheten A. C og D, utsikt over a-underenheten i solid og tegneserierepresentasjon sett fra utsiden og ser ut fra grensesnittet med henholdsvis c-ringen med aH1 i blek cyan. Konserverte polare rester er gule, posisjonene til humane mutasjoner assosiert med patologier (se Tabell S1) er røde. Den rosa sfæren betegner den konserverte Arg – 179 i aH5 som er viktig for protontranslokasjon. Den nedre pilen indikerer innløpsveien for protoner som overføres Til Glu-59 i c-terminal α-helix-II av c-ringen. De bæres rundt ringen ved rotasjon mot urviseren som sett ovenfra, til De kommer Til Arg-179 hvor de går inn i utgangsveien, betegnet med den øvre pilen.

Strukturer av bakterielle ATP-syntaser

Figur Bakterielle ATP-syntaser. (A)F1-Atpase fra Caldalkalibacillus thermarum ved 2,6 Hryvnias oppløsning ved Røntgenkrystallografi; (B) ATP-syntaseenzym Fra Paracoccus denitrificans ved 4 Hryvnias oppløsning ved Røntgenkrystallografi; (C) ATP-syntase fra Escherichia coli ved 7 Hryvnias oppløsning ved cryo-EM.

I Forhold til de omfattende studiene som vi har utført på mitokondriale enzymer, har strukturer av bakterielle ATP-syntaser blitt lite undersøkt, bortsett fra strukturer Av F1 katalytiske domener av enzymer fra Escherichia coli og Geobacillus stearothermophilus (tidligere Bacillus stearothermophilus) ved henholdsvis 3,2 og 3,9 Å oppløsning, og strukturer av c-ringene fra deres membrandomener fra forskjellige arter . For å fylle denne lacunaen har vi hittil bidratt til strukturen av hele enzymet Fra Paracoccus denitrificans ved 4 Å oppløsning, og i samarbeid Med Professor Gm Cook og kolleger I Dunedin, New Zealand, strukturene Av F1 katalytiske domener AV ATP-syntaser Fra Caldalkalibacillus thermarum, Fusobacterium nucleatum og Mycobacterium smegmatis. C. thermarum er en termoalkalifil, og strukturen av dets katalytiske domene ved 2,6 Å oppløsning er den mest nøyaktige strukturen av en bakteriell F1-ATPase som ennå er bestemt . Enzymet Fra M. smegmatis er nært knyttet til enzymet Fra m. tuberculosis. Strukturen av dets katalytiske domene er bestemt til 4 Å oppløsning og gir et mål for utvikling av nye anti-tuberkulære legemidler . Det opportunistiske periodontale patogenet, Fusobacterium nucleatum, er forbundet med et bredt spekter av sykdommer, inkludert orale infeksjoner, svangerskapsutfall, gastrointestinale sykdommer og aterosklerose. Det har også vært knyttet til utvikling og progresjon av kolorektal kreft via hemming av anti-tumor immun signalveier og påfølgende fremme av chemoresistance. Det er en obligatorisk anaerob og par den frie energien til dekarboksylering av glutaconyl-CoA til crotonyl-CoA til transport Av Na + – ioner over sin cellulære membran for å generere en natriumionmotivkraft (smf). ATP-syntasen bruker smf til å drive syntesen AV ATP som kreves for katabolske og anabole reaksjoner. Strukturen til Det F1-katalytiske domenet er bestemt ved 3,6 Å oppløsning . Ved bruk av cryo-EM er det publisert et kart over intakt ATP-syntase av E. coli som viser ε-underenheten i» opp » – posisjon (se nedenfor) , og i det siste har DET blitt fastslått en struktur AV ATP-syntasen fra Geobacillus stearothermophilus til 3 Å .

Struktur av PARASITT ATP-syntaser

Figur F1-Atpasen Fra Trypanosoma brucei. Α-, β-, γ-, δ-, ε-og p18 underenheter er henholdsvis rød, gul, blå, grønn, magenta og cyan. (A og B) Tegneserie representasjoner av side og topp utsikt; (C-E) overflate representasjoner av (C), storfe F1-ATPase, (D), T. brucei-enzym i grått med p18 fjernet og de fargede delene som viser aminosyrene i tillegg til bovint enzym, Og (E), T. brucei-enzymet med p18 tilstede. strukturen og funksjonene TIL KOMPONENTENE I ATP-syntaser, spesielt de underenhetene som er involvert direkte i den katalytiske dannelsen AV ATP, er mye bevart i metazoaner, sopp, eubakterier og plantekloroplaster. På grunnlag av et kart på 32.5 Å oppløsning bestemt in situ i mitokondriene av euglenozoan parasitten, Trypanosoma brucei, ved elektronkryo-tomografi, har det blitt foreslått AT ATP-syntasen i denne arten har en ikke-kanonisk struktur med forskjellige katalytiske steder, hvor den katalytisk essensielle argininfinger er tilveiebrakt, ikke av den α-underenheten ved siden av det katalytiske nukleotidbindingsstedet, som i alle arter undersøkt til dags dato, men av et protein kalt p18 som bare finnes i euglenozoa . I et samarbeid med Drs Alena Zíková og Ondřej Gahura fra Institutt for Parasittologi i České Budějovice i den tsjekkiske Republikk, vi har preget F1-ATPase fra T. brucei og fastsatt en krystallstruktur av enzymet på 3,2 Å oppløsning . Denne strukturen viser at forslaget om at det katalytiske domenet til DENNE ATP-syntasen har en ikke-kanonisk struktur og forskjellige katalytiske steder, er feil. I mange henseender er strukturen Til T. brucei F1-ATPase nært lik De Av F1-Atpaser som tidligere ble bestemt. Den α3β3-sfæriske delen av det katalytiske domenet, hvor de tre katalytiske nettstedene er funnet, pluss den sentrale stengelen, er sterkt bevart, og argininfingeren leveres konvensjonelt av α-underenhetene ved siden av hvert av de tre katalytiske nettstedene som finnes i β-underenhetene. Således har enzymet en konvensjonell katalytisk mekanisme. Strukturen adskiller seg fra tidligere ved å ha en p18-underenhet, identifisert bare i euglenozoa, knyttet til den ytre overflaten av hver av de tre α-underenhetene, og derved utarbeide F1-domenet. Underenhet p18 er et pentatrikopeptid repeat (PPR) protein med tre PPRs og ser ut til å ikke ha noen funksjon i enzymets katalytiske mekanisme. T. brucei er den utløsende agent for sovesyke hos mennesker og relaterte sykdommer hos husdyr som lever I Afrika Sør For Sahara, og strukturen I Sin F1-Atpaser gir et mål for utvikling av nye legemidler for behandling av sykdommen.

kardiolipins rolle

det anioniske lipidkardiolipin er en viktig komponent i aktive ATP-syntaser. I metazoans inneholder deres rotorer en ring på åtte c-underenheter som består av henholdsvis indre og ytre sirkler av N – og C-terminale α. Begynnelsen Av Den C-terminale α-helix inneholder en strengt konservert og fullstendig trimetylert lysinrest i membranets lipidhodegruppe. Større ringer av kjent struktur, fra c9-c15 i eubakterier og kloroplaster, bevare enten en lysin eller en argininrest i ekvivalent posisjon. I datasimuleringer av hydratiserte membraner som inneholder trimetylerte eller ikke-metylerte bovine c8-ringer og bakterielle c10-eller c11-ringer, ble hodegruppene av kardiolipinmolekyler selektivt assosiert med disse modifiserte og umodifiserte lysinrester og med tilstøtende polare aminosyrer, og med et andre konservert lysin på motsatt side av membranen, mens fosfatidyllipider ble tiltrukket lite til disse områdene .

Figurmoduser for binding av kardiolipin til trimetylerte c8-ringer. N-og C-terminale α av c-underenheter er henholdsvis mørke og lysegrå. Kardiolipinmolekyler er grønne, med rosa fosfatgrupper. Store fargede kuler representerer de grove kornperlene for spesifikke aminosyrer, som indikert, som ligger innenfor 0,7 nm av fosfatperlene av kardiolipin. Deler a Og B, hovedgrupperegionen av kardiolipin i den indre brosjyren av membranen bundet, henholdsvis til to tilstøtende c-underenheter (underenheter 8 og 1), og til en enkelt c-underenhet; del C, et kardiolipinmolekyl i den ytre brosjyren av membranen bundet til en enkelt c-underenhet.

imidlertid var oppholdstiden for kardiolipinmolekyler med ringen kort, og tilstrekkelig for at rotoren bare kunne dreie en brøkdel av en grad i det aktive enzymet. Med demetylerte c8-ring og med c10 – og c11-ringer økte tettheten av bundet kardiolipinmolekyler på dette stedet, men oppholdstiden ble ikke endret sterkt. Disse svært spesifikke, men korte interaksjonene med den roterende c-ringen er i samsvar med funksjonelle roller for kardiolipin ved stabilisering og smøring av rotoren, og ved interaksjon med enzymet ved innløp og utgang av transmembranprotonkanalen, i deltakelse i protontranslokasjon gjennom membrandomenet til enzymet.

> filmsimulering av interaksjon av kardiolipin med den innfødte bovin c8-ringen. Protein ryggrad er vist i lys grå, med sidekjeder Av Lys – 43 (rød), Gln-44 (gul), Gln-45 (blå) og Ser-48 (cyan) vist som kuler. Kardiolipinmolekyler vises som grønne pinner, med fosfater som rosa kuler; POPC og POPE molekyler vises som mørkegrå pinner med fosfater som mørkegrå kuler.