BESKRIVELSE og GENERELLE NOTATER

Restriction endonucleases (REs) er bakterielle enzymer som spalter dobbeltstrenget DNA. Type i REs er viktig i bakteriell funksjon, men spalter IKKE DNA ved bestemte sekvenser. Type II REs, beskrevet for bruk i denne håndboken, krever svært spesifikke steder FOR DNA-spaltning og er dermed ekstremt nyttige verktøy i molekylærbiologi. Disse enzymene tillater kloning og rensing av definerte DNA-fragmenter. De 500 eller så kjente REs er vanligvis isolert fra en rekke bakteriestammer.

REs er tilstede i bakterier antagelig for å ødelegge DNA fra utenlandske kilder (f.eks infisere bakteriofag) ved å spalte den fremmede DNA på bestemte gjenkjenning steder. Vertsbakteriens DNA er beskyttet mot spaltning fordi de spesifikke gjenkjenningsstedene er modifisert, vanligvis ved metylering på en av basene i stedet, noe som gjør stedet ikke lenger et substrat FOR RE spaltning. Praktisk Sett Har REs med forskjellige gjenkjenningsstedspesifikasjoner blitt renset fra forskjellige bakteriestammer og brukes av molekylærbiologer under definerte forhold for å spalte renset DNA fra eukaryotiske kilder til definerte fragmenter i en in vitro-reaksjon. Vertsbakterier som brukes til å forplante klonet DNA i laboratoriet, er vanligvis mutante i vertsbegrensningsgenene (hsdR, hsdM eller hsdS); dermed vil deres intracellulære enzymaktiviteter ikke ødelegge de fremmede rekombinante sekvensene.

disse endene er komplementær («klebrig») og kan enzymatisk festes til enhver annen ecori-generert termini ved hjelp av t4 dna ligase. Andre REs gjenkjenner forskjellige sekvenser og lager unike spalter som resulterer i andre definerte termini, hvorav noen også har 5′ utstående ender, 3′ utstående ender, eller ingen utstående (stumpe) ender (Se Tabell 5.1). HVER RE har en bestemt sekvens og antall nukleotider som kreves for å opprette gjenkjenningsstedet. Noen REs krever ikke et bestemt nukleotid i hver posisjon på gjenkjenningsstedet. For eksempel er i noen tilfeller et purinukleotid (A Eller G) i en definert posisjon tilstrekkelig. Frekvensen som EN RE vil kutte DNA med, er dermed relatert til antall baser i gjenkjenningssekvensene (hvis flere baser kreves, er færre kutt egnet til å bli gjort) og de spesifikke basene i enhver posisjon.REs er nyttige fordi deres spesifisitet og den resulterende ligatable termini tillater disseksjon, analyse og restrukturering AV DNA på en kontrollert, forutsigbar, stedsspesifikk måte. Fordi de er enzymer, har hver spesifikke krav til forhold som fører til optimal spaltningsaktivitet. Heldigvis er mange aktive under lignende forhold, med den primære variabelen som ionisk styrke (dvs.NaCl i bufferen). Praktiske forhold er empirisk definert for å bruke HVER RE som et forskningsverktøy.

MENGDEN RE-aktivitet er vanligvis ikke definert ved bruk av klassisk enzymkinetikk. SNARERE ER RE-aktivitet definert i praksis for bruk i laboratoriet. En aktivitetsenhet (U) for EN RE er vanligvis definert som mengden enzym som vil kutte 1 µ på alle spesifikke steder i EN DNA-prøve (vanligvis bakteriofag λ) i 1 time ved 37°C. Den faktiske aktiviteten som oppnås kan være forskjellig hvis det er flere steder for FORDØYELSEN. For eksempel, hvis 1 U AV EN RE er tilstrekkelig til å kutte 1 µ bakteriofag λ DNA helt på ett sted under standardanalysevilkår, kan det hende at det ikke er mulig å kutte helt 1 µ AV EN DNA-prøve som har fire steder for EN RE, eller en prøve som ikke er tilstrekkelig renset.

Andre faktorer vedrørende reaksjonsbetingelsene påvirker OGSÅ RE-aktivitet. Disse inkluderer renhet AV DNA, buffer, temperaturforhold og RE selv. DNA-metylering, bundet protein eller overdreven viskositet AV DNA med HØY molekylvekt i viskøse løsninger kan redusere effektiviteten AV EN RE-fordøyelse. DNA som skal kuttes bør vanligvis være fri for urenheter; SS-fenol / kloroform ekstraksjon og etanol utfelling (Seksjon 20-1) vil fjerne mange forstyrrende urenheter. I kontrast er de fleste REs vanligvis ikke negativt påvirket AV RNA ELLER enkeltstrenget DNA. Dermed kan tilsetningen av tRNA som en coprecipitant være nyttig for å gjenopprette små mengder DNA uten å påvirke påfølgende re-fordøyelser.

den typiske analysetilstanden for EN RE-reaksjon inneholder en buffer (10 mM Tris, pH 7,4 er vanlig), 10 mM Mg2+, og er fri for betydelige konsentrasjoner av chelateringsmidler (TE buffer inneholder en tilstrekkelig lav MENGDE EDTA). RE-bufferne inneholder også riktige saltkonsentrasjoner for å gi optimal ionisk styrke for HVER RE. I noen tilfeller tilsettes BSA, dtt og spermidin for å gi optimal enzymaktivitet. Fire generaliserte RE-buffere kan tilfredsstille kravene til de fleste REs, og forhåndsforberedelsen av 10 × av disse bufferne er beskrevet nedenfor. De FLESTE re fordøyelser utføres på 37°C, selv om Det er noen få unntak, for Eksempel TaqI.

De fleste Kjøpte REs sendes med en passende lagringsbuffer, men dette inneholder 25-50% glyserol for å forhindre frysing under lagring ved -20°C. Konsentrasjoner av glyserol på over 5% (vol/vol) i re-fordøyelsesanalyser kan hemme aktiviteten til mange REs. i tillegg kan høye glyserolkonsentrasjoner under re-fordøyelse slappe av sekvensspesifikiteten til noen REs, noe som resulterer i falske spalter. For eksempel er dette fenomenet sett med den vanlige Re EcoRI, hvor den falske aktiviteten observert under noen forhold kalles EcoRI * (stjerne) aktivitet. Av disse grunner er det viktig å gjøre volumet AV re-fordøyelsesreaksjonen stort nok til å omfatte minst en 1: 10 fortynning av RE selv (og dermed redusere glycerolkonsentrasjonen). Andre faktorer, som pH, etanol eller feil saltkonsentrasjon kan også forårsake stjerneaktivitet eller redusert aktivitet; derfor er nøye overholdelse av anbefalte forhold viktig.

noen andre hensyn er nyttige når Du bruker REs. Bruk en ny pipettespiss hver gang EN RE overføres. Spormengder av forurensning lagt TIL re lager kan hindre videre bruk og forvirre resultater oppnådd i senere eksperimenter. Ved optimalisering av reaksjoner er det bedre å legge til ekstra RE enn å inkubere mye lenger enn 1 time. Videre, som nevnt ovenfor, er enzymaktivitet bare definert for å kutte EN DNA-standard. Fordi prøven er generelt ganske forskjellig fra standard, en god guide er å bruke ca 2-3 U AV RE per mikrogram AV DNA som skal kuttes, spesielt når du prøver å fordøye en vanskelig prøve. Det kan noen ganger være nødvendig å titrere MENGDEN RE som trengs for å fordøye EN DNA-prøve på riktig måte.

Til slutt, hvis to REs skal brukes, må det tas hensyn til de optimale saltforholdene til hver. Hvis begge krever samme buffer, kan fordøyelsen gjøres enten samtidig eller sekvensielt. Hvis det kreves forskjellige saltforhold, MÅ RE som krever mindre salt brukes først. Etter inkubasjon justere salt tilstand, og fordøye MED RE krever høyt salt. RE aktivitet kan fjernes VED SS-fenol / kloroform ekstraksjon i alle tilfeller. Noen REs er termolabile og kan inaktiveres ved oppvarming til 70°C i 5 min. Denne egenskapen varierer imidlertid fra EN RE TIL den neste og bor verifiseres for hver re som brukes.