Atp加水分解によって駆動される回転

加水分解回転サイクルは、酵素の触媒F1ドメインにおける三つの120oステップで構成されており、生物物理学的回転実験では”触媒が宿る”と定義されている。 各１ ２ ０ｏステップは、各１ ２ ０ｏステップの後に触媒ドエルによって定義されるサブステップに分割され、介在する「ＡＴＰ結合」ドエルは３ ０ｏで、「リン酸放出」ドエルは９ ５ｏである。 リン酸の放出は、酵素が120oステップを完了し、ATP結合ドウェルに到達することを可能にする。 我々は、リン酸放出と触媒ドウェルでF1触媒ドメインの構造を説明しており、リン酸放出と触媒ドウェルの間の35o回転サブステップは、酵素が”触媒ドウェル”に進むことを可能にする”ATP結合”ドウェルからのリン酸の放出に依存することを示している。 触媒ドウェル自体は、結合したATP分子が加水分解のための態勢を整えられる遷移を表す。 我々の現在の取り組みは、脳症F1-ATPaseの触媒作用を定義することを中心に行われている。

βサブユニットからのリン酸の放出による脳症f1-atpaseにおけるγサブユニットの30o回転のムービー生成。 映画は、リボン表現でF1-チオップの側面からの眺めで始まり、結合したチオリン酸をオレンジ色の球としています。 Αサブユニットとβサブユニットはそれぞれ赤色と黄色である。 次に、ＡＴＰ−、ＡＤＰ−、β ＴＰ−およびβ ＤＰ−サブユニットを順次除去して、ａ Ｅ β ｅ−二量体および中央の茎サブユニットγ、δおよびγ（それぞれ、青色、マゼンタおよび緑色）を残す。 この残留サブ複合体は、aeサブユニットと中央茎の側面図を公開するために、y軸の周りに100°右に回転されます。 その後、δおよびγサブユニットおよび残基γ-42-210が除去され、σ eサブユニットはより暗くなる。 最終的なフレームでは、結合したリン酸が解放され、aEサブユニットが開き、aeサブユニットとγサブユニットの間のパッキング相互作用を中断し、γサブユニットから離れて移動します。 これらの相互作用を再確立するために、γサブユニットは30°回転する。 最終状態の構造は、F1-I3-ThioPに見られるウシF1-ATPaseのリン酸放出後の状態である。

Pmfによって駆動される回転

pmfからの回転の生成を理解するための重要な欠落データは、プロトンが酵素の膜ドメインを通過する経路の原子 これまでに利用可能な最良の構造は、Paracoccus denitrificansからの酵素複合体のX線結晶学によって4Åの分解能で2015年に決定されたものです。 他のものは、2015年と2016年に、ウシおよび真菌酵素の単一粒子のクライオ電子顕微鏡によって、せいぜい6Åの分解能で決定された。 しかし、これらのモデルはすべて、プロトン駆動力からの回転の生成の分子機構の定式化に必要な詳細を欠いており、酵素の運動性と柔軟性のために、酵素の単一粒子は多くの異なる位置を採用することができる。 したがって、それはcryo-emアプローチのための異常に困難な問題を提示します。

P.angusta由来のF-ATPaseの膜ドメインを図に示します。 A-Dでは、a-サブユニットはトウモロコシの花の青色である。 AおよびBは、側面から、および膜ドメインの下から固体表現で表示されます。 Ｃ１ ０環は灰色であり、ｂサブユニット（上部は図示せず）はピンク色であり、淡黄色、赤レンガ色、淡シアン色およびベージュ色のセグメントは膜貫通αヘリックスであり、サブユニットｆ、ＡＴＰ８、Ａ Ｈ１およびＢ Ｈ１にそれぞれ割り当てられたＣ Ｈ１−Ｃ Ｈ４である。 C環では、i-IVはサブユニットaと接触している四つの膜貫通C末端αヘリックスを示している。CとDは、aサブユニットの外側から見た立体表現と漫画表現であり、c環との界面から見た漫画表現であり、ah1は淡いシアンである。 保存された極性残基は黄色であり、病理に関連するヒト変異の位置（表Ｓ１参照）は赤色である。 ピンクの球は、プロトン転座に不可欠であるah5で保存されたArg-179を示しています。 下の矢印は、c-環のC-末端α-ヘリックス-II中のGlu-59に移動するプロトンの入口経路を示している。 それらは上から見た反時計回りの回転によってリングの周りに運ばれ、Arg-179に到着し、そこで上の矢印で示される出口経路に入る。

細菌ATPシンターゼの構造

図細菌ATPシンターゼ。 (A)Caldalkalibacillus thermarumのF1-ATPaseをX線結晶学によって2.6Åの分解能で、(B)Paracoccus denitrificansのATPシンターゼをX線結晶学によって4Åの分解能で、(C)大腸菌のATPシンターゼをcryo-EMによっ

ミトコンドリア酵素について行った広範な研究と比較して、細菌ATPシンターゼの構造は、それぞれ3.2および3.9Åの分解能での大腸菌およびGeobacillus stearothermophilus（旧Bacillus stearothermophilus）の酵素のF1触媒ドメインの構造および様々な種の膜ドメインからのc環の構造を除いてほとんど研究されていない。 このラクナを埋めるために、これまでにParacoccus denitrificansの酵素全体の構造を4Åの分解能で貢献し、ニュージーランドのDunedinのG.M.Cook教授らと共同で、Caldalkalibacillus thermarum、Fusobacterium nucleatumおよびMycobacterium smegmatisのATPシンターゼのF1触媒ドメインの構造を貢献してきた。 C.thermarumはthermoalkaliphileであり、2.6Åの決断の触媒作用の範囲の構造はまだ定められた細菌F1-ATPaseの最も正確な構造です。 Mからの酵素。 スメグマティスは結核菌由来の酵素と密接に関連している。 その触媒ドメインの構造は4Åの解像度に決定されており、新しい抗結核薬の開発のためのターゲットを提供しています。 日和見的な歯周病原菌であるFusobacterium nucleatumは、口腔感染症、妊娠転帰の進行、胃腸疾患、アテローム性動脈硬化症などの幅広い疾患に関連している。 また、抗腫瘍免疫シグナル伝達経路の阻害およびその後の化学抵抗性の促進を介して、結腸直腸癌の発症および進行と関連している。 これは偏性嫌気性であり、グルタコニルCoAの脱炭酸の自由エネルギーをクロトニルCoAに結合し、その細胞膜を横切るNa+イオンの輸送に結合してナトリウムイオン原動力（smf）を生成する。 ATPのシンターゼは異化作用および同化反作用に必要なATPの統合を運転するのにsmfを使用します。 そのF1触媒ドメインの構造は3.6Åの分解能で決定されています。 Cryo-EMを用いて、大腸菌の無傷のATP合成酵素のマップが”up”位置にγサブユニットを示す（下記参照）が公開されており、最近、Geobacillus stearothermophilusのATP合成酵素の構造が3Åに決定されている。

寄生虫ATPシンターゼの構造

トリパノソーマブルセイのF1-Atpアーゼを図に示します。 Α-、β-、γ-、δ-、γ-、およびp18サブユニットは、それぞれ赤、黄、青、緑、マゼンタおよびシアンである。 （ＡおよびＢ）側面図および上面図の漫画表現；（Ｃ−Ｅ）（Ｃ）、ウシＦ１−Ａｔｐアーゼ、（Ｄ）、Ｔの表面表現。 brucei酵素はp18を除去した灰色で、ウシ酵素に付加的なアミノ酸を示す着色された切片、および（E）、p18存在するT.brucei酵素を示す。

ATPシンターゼの構成要素、特にATPの触媒形成に直接関与するサブユニットの構造と機能は、メタゾアン、真菌、真正細菌および植物葉緑体に広く保存されている。 32の地図に基づいて。Euglenozoan寄生虫Trypanosoma bruceiのミトコンドリアのin situで決定された5Åの分解能電子クライオトモグラフィーにより、本種のATP合成酵素は、これまでに調査されたすべての種のように、触媒ヌクレオチド結合部位に隣接するα-サブユニットではなく、p18と呼ばれるタンパク質によって、触媒的に必須のアルギニン指が提供される異なる触媒部位を有する非カノニカル構造を有することが提案されている。 チェコ共和国のチェスケブジェヨヴィツェ寄生虫研究所のAlena Zíková博士とOndřej Gahura博士との共同研究では、T.bruceiのF1-ATPaseを特徴づけ、3.2Åの分解能で酵素の結晶構造を決定した。 この構造は、このATP合成酵素の触媒ドメインが非カノニカル構造を有し、異なる触媒部位が間違っているという提案を示している。 多くの点で、T.brucei F1-ATPaseの構造は、以前に決定されたF1-Atpaseの構造と密接に類似している。 触媒ドメインのα3β3球状部分は、三つの触媒部位が見出され、中央の茎に加えて、高度に保存されており、アルギニン指は、βサブユニットに見られる三つの触媒部位のそれぞれに隣接するαサブユニットによって従来から提供されている。 従って、この酵素は、従来の触媒機構を有する。 この構造は、三つのαサブユニットのそれぞれの外部表面に関連付けられたユーグレノゾアでのみ同定されたp18サブユニットを有し、それによってF1ドメインを精緻化することによって、以前のものとは異なる。 サブユニットp18は、三つのPprを有するペンタトリコペプチドリピート（PPR）タンパク質であり、酵素の触媒機構に機能を持たないように見える。 T.bruceiは、サハラ以南のアフリカに住む家畜におけるヒトおよび関連疾患の睡眠病の原因物質であり、そのF1-Atpaseの構造は、この疾患を治療するための新

カルジオリピンの役割

アニオン性脂質カルジオリピンは、活性ATPシンターゼの必須成分である。 メタゾアンでは、それらのローターは、それぞれN末端αヘリックスとC末端αヘリックスの内側と外側の円からなる八つのcサブユニットの環を含む。 C末端αヘリックスの始まりは、膜の脂質ヘッドグループ領域に厳密に保存され、完全にトリメチル化リジン残基が含まれています。 真正細菌および葉緑体のc9-c15からの既知の構造のより大きな環は、リジンまたはアルギニン残基のいずれかを同等の位置に保存する。 トリメチル化またはメチル化されていないウシc8リング、および細菌c10またはc11リングを含む水和膜のコンピュータシミュレーションでは、カルジオリピン分子のヘッドグループは、これらの修飾および未修飾リジン残基と隣接する極性アミノ酸と選択的に関連付けられ、ホスファチジル脂質は、これらのサイトに少し引き付けられたのに対し、膜の反対側に第二保存リジンとなった。

トリメチル化されたc8環へのカルジオリピンの結合の図モード。 CサブユニットのN末端αヘリックスとC末端αヘリックスは、それぞれ暗い灰色と明るい灰色である。 カルジオリピン分子は緑色で、ピンクのリン酸基を有する。 大きい着色された球は示されるように特定のアミノ酸のための粗粒のビードを、cardiolipinの隣酸塩ビードの0.7nmの内にある表す。 パートAとB、二つの隣接するcサブユニット（サブユニット8と1）に、それぞれ、結合した膜の内側リーフレットにおけるカルジオリピンの頭部群領域、および単一のcサブユニットに;パートC、単一のcサブユニットに結合した膜の外側リーフレットにおけるカルジオリピン分子。

しかし、環を有するカルジオリピン分子の滞留時間は短く、回転子が活性酵素の一部のみを回転させるのに十分であった。 脱メチル化c8環とc10-とc11-環では、このサイトで結合したカルジオリピン分子の密度が増加したが、滞留時間は大きく変化しなかった。 回転するｃリングとのこれらの非常に特異的ではあるが短い相互作用は，ロータの安定化と潤滑におけるカルジオリピンの機能的役割と一致しており，膜貫通プロトンチャネルの入口と出口で酵素と相互作用することによって，酵素の膜ドメインを介したプロトン転座に関与する。