TissueDecoderの細胞型特異性：AT21署名行列を示すAT21署名行列のヒートマップ（A）AT21署名行列を持つCIBERSORTからの細胞型組成予測、（B）正規化された文献から選択された従来のマーカーの発現および（c）cellmade予測された一次マーカーの正規化された発現。 図の上の一般的なxaxisは、AT21シグネチャ行列からセルタイプに注釈を付けるために使用されるサンプルを示しています。 CellMaDeとCIBERSORTは両方ともAT21署名行列で訓練されているため、（A、C）は両方の技術にとって最適な結果であり、（B）はAT21署名行列上の従来のマーカーの分離力を表 緑色のボックスは、各セルタイプ（列）に対して、対応するマーカーを持つ行を示します。

これらの評価の隣に、我々はAT21署名行列とCIBERSORTベースのデコンボリューションをテストするために独立したクロスプラットフォーム（異なるAffymetrixマイクロアレイプラット）検証データセットを利用し、我々のアプローチは、正しく検証データセット内のすべてのテストされたセルタイプのためのそれぞれの分離されたセルタイプのための最高の割合を提供することを示している（補足図。 S1C）。

単離された細胞型の平均推定パーセンテージは、皮下脂肪細胞で69.2％、ASCsで57.1％、B細胞で89.9％、84である。CD4+T細胞では8%、CD8+T細胞では71.0%、NK細胞では62.0%、単球では90.5%である。 脂肪組織（単球/マクロファージ）のCD14+画分は、主にマクロファージ（25.4％）、骨髄樹状細胞（24.4％）および単球（18.1％）で構成されると予測される。 参照データ自体に基づく最適結果からの偏差（図。 3A)は、検証データセットと参照データセットとの間のクロスプラットフォームの違いによって説明することができる(検証データセットと参照データセットは、二つの異なるAffymetrixマイクロアレイにハイブリダイズされている)。

cellmade一次および二次マーカー

次に、我々はさらに、それに組み込まれている遺伝子を調査し、一次および二次マーカー基準（Eqs. 方法のセクションの1および2）。 これにより、アレイ上に存在するすべてのプローブが、その一次基準スコアおよび二次基準スコアに従って順位付けされます。 である。 図2Bに示すように、我々は、4つの細胞型（すなわち、ASCs、CD8+T細胞、マクロファージおよび皮下脂肪細胞）からの最高の一次および二次基準スコアを有するトップ10の遺伝子を示し、遺伝子オントロジー用語に従ってそれらの細胞位置を示す（すべての21の細胞型については、補足図を参照）。 S2、補足データS3）。 AT21シグネチャマトリックスに存在するすべての遺伝子は太字でマークされており、CIBERSORTアルゴリズムは主に二次マーカーの組み合わせを選択することを示している（CIBERSORTの遺伝子選択基準は私たちの二次マーカー基準に匹敵する）が、一次マーカーと従来のマーカーは常にシグネチャマトリックスに含まれているわけではない。

これは、単一の（一次）マーカーの細胞型特異性に大きく依存する免疫組織化学などの古典的なマーカーベースのアプローチとは対照的です。

これは、単一の（一次）マー それにもかかわらず、マクロファージのCD68などの従来のマーカーは、単球、形質細胞様樹状細胞10などの他の細胞型でも発現され、線維芽細胞および内皮細胞11、12ではより低い程度でも発現されており、これは比較的低い一次基準スコアによっても示されている（図12）。 2B）。 したがって、我々は、脂肪組織内の細胞型のための代替マーカーとして明らかにする前に、さらに実験的に確認されるCellMaDeによって同定された主要なマーカーを提

cd8+T細胞については、従来使用されているマーカー（分化8Bのクラスター; CD8B）は、非常に驚くべきことではなかった最強の一次マーカーとして同定されています。 しかし、分化４のクラスター（ＣＤ４）は、単球またはマクロファージなどの他の造血細胞型におけるその一般的な発現によって示されるように、ＣＤ４＋ｔ細胞に 図３Ｂ、補足図３Ｂ、補足図３Ｂ。 S2）。 これはまた、フローサイトメトリーにおいて、ＣＤ４が、ＣＤ４＋ｔ細胞を同定するためにＣＤ３＋細胞集団（Ｔ細胞）の同定の後にのみ使用される理由でもある。 デンドロサイトは７つの膜貫通蛋白質（ＤＣＳＴＡＭＰ）を発現し，マクロファージの非常に特異的な一次マーカーとして同定した。 である。 3C我々は、DCSTAMPの高い発現は、以前の研究によって示唆されているように、マクロファージのサブセット、例えばマクロファージ巨細胞のような細胞への特異性を強調する可能性があるマクロファージサンプルのサブセットに限定されていることを観察13。 ASCsのために識別された第一次マーカー EEA1は非常に顕著ではないです。 この細胞型のために、我々はフローサイトメトリーのゲーティング戦略だけでなく、CIBERSORTアルゴリズムで実装されているように二次マーカーの組み合わせを使

皮下脂肪細胞の場合は、プライマリマーカー CMA1もあまり顕著ではないように似ているようです。 しかし、これは、心膜脂肪細胞も参照マトリックスの一部であるという事実に起因する可能性がある。 したがって、この場合、主要な基準は、脂肪細胞を他の細胞型から区別するだけでなく、脂肪細胞を二つの異なるデポから区別することにも焦点を当 したがって、我々は、脂肪細胞のための主要なマーカーを決定するために一緒に参照マトリックス内のすべての脂肪細胞をマージすることによ この分析で脂肪細胞のために同定されたトップ三つの主要なマーカーは、SPARCL1、ADIPOQ、およびTHRSPでした。

同定されたトッププライマーマーカーのさらなる評価のために、我々は394解剖学的に注釈を付けられた組織発現プロファイル（補足図）で構成されるより広範な独立したデータセットでそれらの発現を比較した。 S3、補足的な方法）。 21プライマリマーカーの六つは、完全に提案された細胞型、すなわち内皮細胞のCALCRL、赤芽球のSPTA1、CD8+T細胞のCD8B、B細胞のMS4A1、好酸球のPRSS33、およびマクロファージのDCSTAMPで最高の発現を示すものとして定義されている検証されている。 解剖学的に注釈された394の組織発現プロファイルの上位5つの中にあるか、筋細胞やニューロンなどの脂肪組織に関連しない細胞型でのみより高 唯一の三つのマーカーは、ASCsのためのEEA1、平滑筋細胞のためのRGS5、および血小板のためのpf4V1、PF4v1の検証データセットに血小板が存在しないため、その適切な評価を防止するため、後者の検証されていませんでした。

最後に、独立した検証データセットを利用して、識別されたトッププライマリーマーカーの識別力を評価しました。 この分析の結果は、補足図に示されている。 Ｓ１および補足データＳ２は、皮下脂肪細胞のＣＭＡ１およびＡｓｃｓのＥＥＡ１を除いて、一次マーカーが発現され、検証データセット中の細胞型を区別することができるこ S1B）。

調査結果の文脈化–文献レビュー

評価の次のステップとして、我々は1119SATサンプル（616マイクロアレイと503RNA-Seqデータセット）と51オート麦サンプルのデコンボリューションアプローチの推定値を比較するために、ヒト脂肪組織細胞型組成の定量的文献レポートをコンパイルしている文献で報告された割合に。

まず、脂肪組織中の脂肪細胞の割合を定量化する文献のレポートを検索しました。 この検索は、〜93％14、〜70％15,16および〜15％17からの推定値の範囲を明らかにし、これは、サンプル処理（例えば、血管の除去）および計数方法（例えば、組織学対細胞単離、異な 最近、Glastonburyたちは、2つの集団レベルの皮下脂肪組織RNA-Seqデータセット(TwinsUK、n=766およびGenotype-Tissue Expression project、n=326)の脂肪細胞画分を、4つの異なる細胞型(脂肪細胞、マクロファージ、CD4+t細胞、および微小血管内皮細胞)の相対的な比率を推定することによって推定した。 脂肪細胞の中央値パーセントのための彼らの推定はGTExのための62%および82%TwinsUK study18である。

その後、我々は非アディポサイト19の画分を決定する研究に集中し、我々のレビューに25の元の研究を含めました。 これらの研究から抽出された細胞画分の定量的結果を図１ ０に示す。 4および補足データS4(方法論の詳細については、補足方法を参照)。 マクロファージの報告された細胞数は大きく異なり、いくつかの研究では総細胞の1％未満の平均数から、別の研究では総細胞の27％の平均までの範囲で 研究の間のこれらのかなり大きな違いは、（i）分析されたサンプル間の実際の生物学的違い、（ii）マクロファージの局所濃縮（例えば、）を含むいくつかの要因に 特に免疫組織化学のような低い総細胞数、（iii）利用された方法論とマーカーの間の技術的な違い、および（iv）サンプルの取り扱いと分析プロトコルの違い（例えば、蛍光 具体的には、いくつかの免疫組織化学研究では非常に高いマクロファージ数が報告されていることに注意することが重要です（Fig. 4A）。 さらに、最も高い大食細胞のパーセント（27%および26%の大食細胞の平均）の2つの調査が”核の総数ごとの大食細胞”で報告する唯一の物であるので異なった調査を渡る報告された単位によるある相違があるかもしれません。 我々は、組織切片からの免疫組織化学研究が、断面（薄い組織切片）からの観察に依存するために偏っている可能性があることを以前に示している20。 したがって、脂肪細胞に対して特異的には、断面は脂質液滴の部分をカバーするが、核はカバーしない可能性があり、計数方法論の間に体系的な違いが生じると主張することができる。

脂肪組織細胞組成のレビュー：CIBERSORT（緑色）を用いた結果と比較した報告された脂肪組織細胞組成の文献レビュー。 マクロファージ（ａ）、Ａｓｃｓ（Ｂ）、ＣＤ４＋ｔ細胞（Ｃ）、ＣＤ８＋ｔ細胞（Ｄ）、および内皮細胞（Ｅ）の５つの異なる細胞型についての総細胞の平均（点）、最小、および最大（矢印）の割合（補 色は、凡例に示されているように、セルのカウントに使用される方法を指定します。 （A）の灰色の点と矢印は、マクロファージスコアと単球スコアが一緒に追加された結果です。 マクロファージマーカー CD68、HAM56、およびCD14も単球を染色するので、比較として示されている。 (B)の灰色の点は、それぞれの研究で区別された”外膜上脂肪間質細胞”（同じ行の黒い点）と”内皮前駆細胞”の合計を表していますが、AT21シグネチャーマトリックスからの”脂肪幹/間質細胞”スコアで覆われている可能性が高いです。 各プロットの左側には、結果が取られた研究への参照（補足データS4を参照）および利用されたマーカーが示されている。 Ａｓｃｓおよび内皮細胞について、マーカーの組み合わせを使用した（補足データＳ４参照）。 調査の参照の手紙に付す星は調査の関係者に35の上の平均ボディ固まりの索引があったことを示します。 重度の肥満の人ではマクロファージ頻度が増加することが報告されているため、図に含まれています。

研究参加者間の生物学的差異の潜在的な影響を評価するために、特に肥満状態に関して、平均体格指数が35以上（重度の肥満）の人々を含むす 4A）。 肥満状態とマクロファージ数との関係は、いくつかの記事で研究されており、一部では肥満の増加に伴うマクロファージ数の増加を報告しているが、すべ,22,23,24,25,26. それにもかかわらず、肥満の状態は、我々の文献レビューで報告されたマクロファージの割合の間で観察された多様性を説明することはできません（図 4A）。

比較のために、我々は、研究参加者の生物学的な違いと異なるラボ間のサンプルハンドリングの潜在的な違いにもかかわらず、より良い標準化を示し、比較的安定した結果を示す、我々の分析における研究間の違い（SATのみ）を評価した（補足図。 S5）。 デコンボリューションを実行するためにＲＮＡ−Ｓｅｑレベルのデータを使用しても、文献から報告された研究よりも低い分散を生じた（図１ ０Ａ）。 図4、補足図。 S6）。

文献報告と比較して、我々の分析からのマクロファージの推定量は、スペクトルの下端にあり、616SATサンプルの総細胞の1.3％（中央値0.8％、IQR：0.03％-1.8％）および1.2％の総細胞の51オート麦サンプル（中央値1.2％、IQR：0.4％-1.8％）である。 極端を見ると、我々の結果は、非常にまれなケースでは最大25％のマクロファージとマクロファージ組成の広い範囲があることを確認します。

また、文献研究（CD14、CD68、およびHAM56）で利用されるマーカーを発現する単球の潜在的な影響を説明するために、我々はまた、我々のAT21-CIBERSORTアプローチからマクロファージ これは、SATサンプル中の1.5％のマクロファージ/単球と文献で報告された平均値に近接して我々の推定値をもたらすオート麦サンプル中の4.3％のマクロファージ/単球の平均になります。

ASCsの量（SATで14.8％、オートムギで15.7％の平均）、CD4+T細胞（SATで0.9％の平均および0.5％の平均）、Cd4+t細胞（SATで0.9％の平均）、Cd4+t細胞（SATで0.5％の平均）、Cd4+t細胞（SATで本発明者らのアプローチによって推定されたＣＤ８＋ｔ細胞（ＳＡＴおよびＯＡＴの両方で平均０． 4B-E）。 マクロファージと同様に、ASC量の文献報告は大きな変動を示す（図。 4B）。 我々は、この変化を説明する三つの理由を特定しました。 まず、文献研究の3つ（研究s、t、およびv–補足データS4を参照）は、血液で汚染された脂肪吸引吸引液からの脂肪組織を使用し、SVF中のAscの相対画分が低 第二に、いくつかの研究は、内皮前駆細胞と外膜上脂肪幹細胞（例えば、研究uおよびv）を区別するが、他の研究（私たちの研究を含む）は区別しないので、両方の亜集団をASCsとしてカウントする可能性がある。 特に、Zimmerlin27の研究で2つの亜集団を合計すると、結果として得られる平均画分は13.9％（図1の灰色の点）である。 4B)は私達の推定結果に近いです。 第三に、総細胞収量および幹/間質細胞割合は、SVF28、29の単離に使用される方法に応じて大きく変化し、これはViardotおよびcolleagues30によって報告された非常に低

形質細胞様樹状細胞、好中球、好酸球などのいくつかの細胞型があり、文献では結果が得られなかったため、ヒト脂肪組織での頻度を初めて報告している。 血小板および赤芽球のようなある細胞のタイプはAT21署名のマトリックスに対照として主に含まれ、サンプル内の血の存在の同一証明を可能にす

脂肪組織から単離された細胞型との参照データセット

AT21デコンボリューションの結果のさらなる検証のために、我々は脂肪組織から単離された四つの細胞画分からなるAT4シグネチャーマトリックスに基づいてデコンボリューションと比較した。

研究集団と組織サンプリング手順の違いを除外するために（細胞型の粒度、参照サンプルの違いを維持し、クロスプラットフォーム分析を実行しながら）、我々は779affymetrixヒトU133プラス2.0アレイからの脂肪組織サンプルをdeconvolveするex-vivo参照を使用し、我々は前に私たちのAT21シグネチャーマトリックスで分析した。 得られたセル百分率（補足図。 S7）は、AT21を基準として得られた結果と同様の範囲にあり（単球/マクロファージの割合は少し高いが）、それらと合理的によく相関し、0.41と0.87の間のSpearman S8）。 それにもかかわらず、我々の分析は、全体的な分布が保存されているが、細胞の種類とその起源の選択は、結果の詳細のレベルに潜在的な影響を与えるこ

私たちのデコンボリューションアプローチのさらなる評価のために、我々は53％の幹/間質細胞、27％の単球/マクロファージ、19％の他の白血球、および平均して1％の脂肪細胞の細胞型分布を明らかにし、脂肪組織の間質血管画分（また、データセットGSE80654から）からなるデコンボリューションサンプルにこの”ex-vivoリファレンス”を使用しました（補足図を参照）。 S9)合計n=6人のうちn=10人の個人から。 残りの4人のデータは入手できませんでした。 フローサイトメトリーの結果は、元の研究ではn=10個体のより大きなサンプルサイズから来ているにもかかわらず、62％の幹/間質細胞、13％の単球/マクロファージ、12％の他の白血球、3％の内皮細胞、-10％の不特定）のわずかに異なる平均を報告した31。 両方の結果は、脂肪組織における幹/間質細胞の量が多いことを確認し、（SVFの細胞から脂肪組織の細胞への単位変換後–方法を参照）AT21を脂肪組織に適用した平均的な結果と合理的に類似している。

四つの脂肪組織デポの比較

次に、四つの脂肪組織デポ（SAT、オート麦、PAT、およびEAT）の細胞型組成を、それらの平均細胞型組成を報告することによ 図5に示すように、補足図に詳述されている。 S4）。 これは、SATが脂肪細胞の割合が最も高く（74％）、次いでオート麦（66.4％）、EAT（59.5％）およびPAT（59.4％）であり、EATおよびPATはオート麦（9.8％）およびSAT（7.4％）と比較してはるかに多 さらに、オートムギは幹/間質細胞の最も豊富な供給源である（SATの17.2％と比較して14.9％、14.2％と比較して17.2％）。食べるための1%およびPATのための12.4%）。

脂肪デポあたりの細胞型の推定割合：（A）様々な脂肪組織デポの全体的な細胞型分布を示す円グラフ（Subcutaneous–n=616、大網–n=51び心外膜−ｎ＝６ ６、および心外膜−ｎ＝４ ６）は、脂肪組織（免疫細胞、幹／間質細胞、脂肪細胞、および他の）における細胞の４つの主要なアーキタイプの観点から見た。 （Ｂ）各脂肪組織デポからの免疫細胞区画の詳細な分布を示すバープロット。 すべての値は、それぞれのデポからの分析されたサンプルの平均値である。

これらの結果は、サンプルが収集された人々の数と特性の違いのために注意して解釈する必要があります。 EATおよびPATへのアクセスは、それらの生理学的位置およびサンプリング手順の侵襲的性質のために厳しく制限されている。 従ってPATのサンプルは66人の患者（年齢）から取られました: 66±8年）冠動脈疾患（CAD）32とEATサンプルは、11新生児（6-24日齢）、28幼児（40日-1歳）と7子供（2-7歳）先天性心疾患（CHD）33から採取しました。

EATおよびPATドナーの年齢の違いにもかかわらず、EATおよびPATにおける免疫細胞原型の組成は、SATおよびオート麦のサンプルとは非常に異なっているが、互いに著しく類似している。 これは、我々の結果の堅牢性だけでなく、心臓を取り巻くこれら二つの脂肪組織デポにおける細胞型組成の保存された性質を示しています。さらに、我々は、EATおよびPATに浸潤したb細胞、CD8+およびCD4+T細胞を含む古典的に指定された「適応」免疫細胞の画分を報告する。

さらに、我々は、EATおよ これらの適応免疫細胞は、SATおよびオート麦貯蔵所と比較してEATおよびPATが豊富である（EATよりもPATが高い）が、これは、CD8+T細胞について以前に報告されたように、CADまたはCHDを有する患者からの分析されたサンプルの起源に起因する可能性が高い34。 我々の発見はまた、Mazurekとcolleagues35によってサポートされており、冠動脈バイパス移植を受けている患者におけるEATとSATの両方でサイトカインの発現を比較し、EATがいくつかの炎症性メディエーターの供給源であることを発見した。

Satとオート麦のより詳細な比較は、Hardy et al. 2011年（データセットGSE20950）、両方のデポが同じ個人から利用可能であった25。 この分析は、ＳＡＴ中の好中球含量の増加（複数の試験を補正した後も）、およびオート麦中の間葉系幹／間質細胞および平滑筋細胞含量の増加を明らかにした（ 6A）。 好中球（CYP4F3）だけでなく、心膜脂肪細胞（C7）と皮下脂肪細胞（CMA1）のためのCellMaDe由来マーカーの調査は、（また、複数のテストのための調整後）これらの細胞型のSATとオー

表現型形質にわたる脂肪組織組成：（A）zスコアに基づいて、異なるカテゴ各グループが他のグループから離れている標準偏差の数）。 有意な結果（修正されていないp<0.05）のみが色付けされます。 星は多数のテストのための訂正の後で重要にとどまる結果を分類する。 Beanプロットは、（B）すべての有意な細胞型、および（C）ASCsおよび皮下脂肪細胞（有意として検出されない）を、より重い対より痩せた双子の不和な研究のために示す。 Y軸は、双子のペア内の重い双子と細い双子の間の推定されたセル画分の違いを記述します。

表現型形質間の細胞型組成

最後に、我々は、このような異なる性別、年齢、ボディマス指数（BMI）、および2型糖尿病の開発の異なる段階 さらに、我々は、sat細胞型組成物に対するカロリー制限またはレスベラトロール摂取の効果を調査する介入研究が含まれていた。 これらの解析の結果を図１ ０に示す。 図6および補足図でより詳細に説明する。 S10および補足データS5。

男性と女性の間でSAT細胞組成に有意差が認められ、女性には形質細胞様樹状細胞、CD4+T細胞、血小板、軟骨細胞が多く、男性にはCD8+T細胞、線維芽細胞、内皮細胞が多いことが示された。 特に、CD4+およびCD8+T細胞の差は、複数の試験の補正後にも有意であったが、単一の確立されたまたは細胞由来のマーカーに基づいて検出されなかった。 年齢に関しては、我々は唯一の有意な結果を検出し、年齢の増加に伴って線維芽細胞の量が高いことを示した。

我々は、BMIに関連する四つの比較、すなわち（i）SATの細胞画分とBMIの連続的な関係、（ii）一致する一卵性双生児（重い対スリムツイン、∆BMI<3kg/m2）、（iii）不和な一卵性双生児（重い対スリムツイン、∆BMI>

および（ｉ ｖ）肥満対痩せた小児におけるオートムギ細胞組成の比較。 最初の比較は、BMIがSATの単球、骨髄樹状細胞、血小板、骨芽細胞、軟骨細胞、およびASCsの量と正の相関を示し、皮下脂肪細胞との相関は負であることを示してい 一致双子の間に有意差は検出されないが、不一致双子は、ＣＤ４＋ｔ細胞、赤芽球、骨芽細胞（全て、より重い双子ではより高い）、ならびにＢ細胞（より薄い双子では 6B）。 特に、より重い双子では、より高い量のＡｓｃｓおよびより低い量の脂肪細胞への傾向がある（図１ ０Ａ）。 6C)、BMIとの連続的な関連におけるそれぞれの重要な知見を支持する。 対照的に、bmiとの連続的な関連のいくつかの他の所見は、連続的な関連における潜在的な交絡効果（年齢、性別、または他の要因）に起因する可能性のある

リーン対リーンの比較における重要な結果の欠如 肥満の子供は調査が11のサンプル（5つの肥満および6つの細い子供）の合計だけを含むので限られた力が大抵原因です。

我々は、糖尿病、耐糖能、またはインスリン抵抗性に関連する六つの比較を行いました。 そのうちの三つ（耐糖能障害対SATの正常耐糖能；糖尿病対satの耐糖能障害；およびオート麦のインスリン抵抗性対感受性）は統計的に有意な結果を示さなかった。 インスリン抵抗性対SAT細胞型組成の比較 感受性個体はインスリン抵抗性個体における平滑筋細胞の有意な増加を明らかにした。 我々の分析によると、糖尿病の人々のSATは、正常な耐糖能の人々よりも多くの単球と少数の好酸球を含むが、病的に肥満の人々のオート麦は、骨髄樹状細胞、好酸球（糖尿病の人々の方が高い）、および軟骨細胞（糖尿病のない人々の方が高い）の違いを示す。

我々は、カロリー制限またはレスベラトロール補給が脂肪組織細胞型組成を有意に変化させるという証拠は見出さなかった。

興味深いことに、含まれている研究では、免疫組織化学25（GSE20950）によって決定されるマクロファージの割合も報告されています。 彼らは、インスリン感受性およびインスリン抵抗性の人々からの11のオート麦サンプル（20の研究参加者のうち）のマクロファージ頻度を示し、平均マクロファージ含量は1.8％（全細胞の％への単位変換後）であり、これは1の推定値とうまく一致する。すべての20人の参加者の平均として495％（免疫組織化学のための11サンプルの選択基準は、研究の説明に含まれていなかった）。 彼らはさらに、我々は部分的にすべての20の研究参加者におけるインスリン抵抗性対インスリン感受性の人々の比較のための境界線の意義（0.054のp値）