Dopo l’introduzione di un particolare neuroinvasive e ceppo virulento del virus del Nilo Occidentale (WNV) nel nordest degli Stati Uniti, c’è stata una drammatica epidemia di infezioni fatali in uccelli, accompagnato da molto più piccolo, ma allarmante numero di infezioni fatali in cavalli e gli esseri umani.1,16,17,20,22 Entro 3 anni, il Flavi-virus di nuova introduzione aveva spazzato tutto il continente nordamericano, lasciando sulle sue tracce innumerevoli migliaia di uccelli morti e migliaia di casi confermati di malattia, tra cui centinaia di decessi nei cavalli e negli esseri umani. Le segnalazioni di morbilità e mortalità in altri animali domestici sono state meno numerose. Casi aviari ed equini hanno raggiunto il picco nel Mississippi nel corso del 2002.

All’inizio di novembre 2002, un terrier maltese sterilizzato di 2 anni è stato presentato al veterinario di riferimento con un esordio acuto di rotolamento episodico e incontrollato, che è progredito rapidamente a tremori e atassia di tutto il corpo. Il trattamento iniziale con fenobarbital orale e un breve ciclo di prednisone hanno dato un miglioramento minimo. Dopo 1 settimana, il caso è stato riferito al Centro di salute animale, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University, MS. L’esame neurologico ha dimostrato segni di corea costituiti da movimenti avventizi involontari, irregolari, a scatti che coinvolgono l’intero corpo. Anche i globi oculari hanno dimostrato movimenti erratici simili. Anche la propriocezione cosciente e le reazioni di salto sono state lievemente diminuite negli arti anteriori. Le malattie che causano movimenti avventizi involontari di solito colpiscono aree della corteccia cerebrale, o nuclei extrapiramidali specifici del telencefalo o del tronco cerebrale cranico.10 La diagnosi differenziale comprendeva malattie infiammatorie multifocali-infettive, non infettive e immunomediate. L’esame emocromocitometrico completo e la chimica sierica erano insignificanti e l’analisi del liquido cerebrospinale (CSF) non ha rivelato anomalie significative. Un elettroencefalogramma ha rivelato cambiamenti suggestivi di encefalite. Sulla base dei segni clinici e dei risultati dell’elettroencefalogramma, il cane è stato trattato per cause infettive di encefalite. Durante il ricovero in terapia intensiva, il cane è diventato molto eccitabile. Il trattamento con doxiciclina, clindamicina, diazepam, difenidramina e fluidi non è riuscito a prevenire l’aumento della gravità dei movimenti involontari e dei periodi intermittenti di ipertermia (fino a 108 F/42,2 C).

Sierologia per Toxoplasma gondii, Neospora caninum (ProtaTek, Chandler, AZ), Ehrlichia canis, e Rickettsia rickettsii (Antech, Southaven, MO) erano negativi, e accoppiati siero e CSF titoli per canine cimurro virus e parvovirus (Colorado Veterinary Diagnostic Laboratory, Ft. Collins, CO) ha indicato l’immunità protettiva ma non è riuscito a rivelare la produzione intratecale dell’anticorpo. Dopo 6 giorni di ricovero e trattamento, circa 2 settimane dopo l’insorgenza dei segni clinici, il cane è stato eutanasia a causa del suo deterioramento.

L’esame necroscopico non ha rivelato anomalie grossolane. L’esame microscopico del cervello ha rivelato una meningoencefalite lieve, multifocale, non suppurativa, che ha coinvolto materia grigia o aree miste di materia grigia/bianca come il tronco cerebrale. Questo era caratterizzato da piccoli polsini perivascolari di linfociti all’interno del parenchima e talvolta delle leptomeningi adiacenti. La lieve microgliosi del neuropil spesso accompagnava il risvolto perivascolare (Fig. 1). Focolai di infiammazione, che a volte erano bilaterali, erano presenti nel lobo piriforme e associati giro parahippocampale e ippocampo, il ponte e il midollo e la corteccia cerebellare. Una lesione unica vicino al rafe della linea mediana del midollo a livello dei nuclei olivari consisteva in un’area di necrosi con versamento di fibrina ed emorragia, gruppi di macrofagi (cellule gitter) e molti assoni gonfi (sferoidi) con un paio di piccoli polsini linfocitari nelle vicinanze (Fig. 2). Sferoidi colorati positivamente dal metodo di Bielschowsky per gli assoni.19 Gli unici altri risultati significativi sono stati limitati al fegato, che ha mostrato individualizzazione irregolare degli epatociti, eosinofilia citoplasmatica, picnosi nucleare e lisi degli epatociti (necrosi epatica moderata diffusa acuta), con numerosi epatociti binucleati e senza infiltrazione cellulare infiammatoria significativa. Numerosi lieviti in erba con pseudoiphe (Candida sp.) erano presenti nel muco gastrico senza evidenza di invasione o infiammazione della mucosa.

Fig. 1. Cervello; cane. Piccoli polsini perivascolari sparsi di cellule infiammatorie mononucleate e microgliosi lieve nel lobo piriforme. Si macchia. Bar = 35 µm.

Fig. 2. Midollo allungato; cane. Un’area al rafe della linea mediana del midollo che mostra molti assoni gonfi (sferoidi) indicati dalle frecce, che circonda un’area di necrosi con emorragia e macrofagi. Si macchia. Bar = 70 µm.

La reazione a catena della polimerasi (PCR) per WNV è stata eseguita su cervello fisso e midollo spinale, fegato e reni non fissati. Pezzi di cervello fissato alla formalina del peso di 30-100 mg sono stati rimossi dal midollo allungato vicino al sito lesionato e vari altri siti nel tronco cerebrale, nella corteccia cerebrale e nel cervelletto, risciacquati con acqua e posti nel reagente RNAlater™ (QIAgen, Valencia, CA) per almeno 1 ora prima dell’estrazione dell’RNA. Campioni di midollo spinale, rene e fegato congelati non fissati sono stati estratti senza pre-elaborazione. I campioni di tessuto sono stati interrotti utilizzando un pestello motorizzato (PelletPestle, Kontes, Vineland, NJ) e l’RNA è stato estratto utilizzando il reagente Trizol™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) o le colonne mini spin RNea-sy™ (QIAgen), secondo le istruzioni del produttore. La reazione a catena della trascrittasi-polimerasi nidificata inversa (rtnPCR) è stata eseguita utilizzando i primer nidificati e una modifica del metodo descritto da Johnson et al.,12 con i corredi commerciali del reagente (PCR di OneStep ™ RT, Qiagen, Valencia, CA e Taq SuperPak™, Sigma, St. Louis, MO). Il controllo positivo era a 1 : 1.000 diluizione di RNA aggregato estratto da tessuti aviari non miscelati WNV-positivi (prevalentemente reni e cervello). Le bande di DNA sono state rilevate dopo elettroforesi su gel di agarosio utilizzando GelStar (Cambrex, East Rutherford, NJ). Tre dei cinque pezzi di midollo fissato alla formalina erano positivi su rtnPCR, mentre tutti gli altri esemplari di cervello fisso (corteccia cerebrale, cervelletto e tronco cerebrale) e midollo spinale, rene e fegato non fissati (congelati) erano negativi.

L’immunoistochimica (IHC) è stata eseguita nel tentativo di dimostrare l’antigene WNV. Sezioni di tessuti fissati alla formalina e incorporati in paraffina (FFPE) sono state tagliate a 5 µm e colorate utilizzando un contenitore automatico (Dako, Carpinteria, CA) e reagenti di rilevamento della perossidasi streptavidina-biotina-rafano preconfezionati (LSAB2, Dako), secondo le istruzioni del produttore. Sezioni di cervello, rene, pancreas, fegato, cuore, milza, ghiandola surrenale e lingua sono state macchiate utilizzando anticorpi policlonali murini per WNV (VR-1267-AF, ATCC, Manassas, VA) dopo pretrattamento con proteinasi K (Dako). Questo anticorpo policlonale ha mostrato una moderata colorazione di fondo diffusa in tutti i tessuti, complicando l’interpretazione. Non è stata osservata alcuna colorazione specifica tranne forse nel cervello dove i neuroni mostravano diffusamente una colorazione citoplasmatica leggera uniforme rispetto ai vetrini di controllo colorati con irrelevant1 monoclonale irrilevante. I risultati sono stati considerati equivoci a causa dell’elevata colorazione di fondo e della natura diffusa della colorazione neuronale, con poche variazioni di intensità. Questi risultati hanno suggerito una scarsità di antigene nel cervello del cane, rispetto ai tessuti aviari infetti in cui è stata osservata una colorazione citoplasmatica robusta.

Sezioni cerebrali sono state anche colorate utilizzando anticorpi monoclonali contro nucleoproteina del virus del cimurro canino (CDV-NP, VMRD, Pullman, WA), con risultati negativi. IHC sul cervello FFPE per il virus della rabbia è stato eseguito in un altro laboratorio (Prairie Diagnostic Service, Saskatoon, SK, Canada), con risultati negativi.

Sebbene l’encefalite fatale dovuta a WNV sia ben documentata in molte specie aviarie,22 cavalli,8 e umani,20 segni clinici di malattia causati da questo virus sono stati raramente documentati nei cani. Nelle aree in cui il WNV è endemico, un’alta prevalenza di anticorpi neutralizzanti specifici indica che l’infezione nei cani è comune, anche se la malattia clinica non lo è. Un serosurvey dal Sud Africa, dove WNV è endemica, ha mostrato 37% dei cani aveva anticorpi neutralizzanti per WNV.5 Un serosurvey a New York City, subito dopo la prima identificazione di WNV nell’emisfero occidentale, ha mostrato che una percentuale più alta di cani (10%) rispetto ai cavalli (3%) o agli esseri umani (2,5%) aveva anticorpi neutralizzanti specifici vicino all’epicentro dell’epidemia (Queens).15 Un precedente rapporto del Sud Africa descriveva l’isolamento di un virus, successivamente identificato come WNV, dal cervello di un cane con gravi segni clinici di encefalite.7,21 In un esperimento, l’infezione di tre cani con WNV ha prodotto sieroconversione asintomatica in tutti e tre i viremia misurabili ma in uno solo di questi animali, che è stato successivamente scoperto soffrire di iperadrenocorticismo.5 Uno studio più recente con il ceppo statunitense ha dimostrato viremia a basso livello in tutti e quattro i cani e otto gatti infetti, 2 senza segni clinici nei cani e solo malattia febbrile lieve e transitoria nei gatti.

Sono stati pubblicati due rapporti contemporanei di grave infezione da WNV nei cani statunitensi. Buckweitz et al. descritta evidenza post-mortem di replicazione WNV in molti tessuti di un cane di razza mista di 11 anni, maschio con malattia renale e del sistema nervoso centrale( SNC); la reazione a catena quantitativa della trascrittasi–polimerasi inversa (RT-PCR) ha rilevato che le sequenze virali erano più abbondanti nel rene, seguite da cuore, cervello, polmone e milza.6 Lichtensteiger et al. descrivi i risultati postmortem dopo l’eutanatizzazione di un cane di razza mista di 8 anni con grave malattia somatica che includeva miocardite e encefalite WNV fatale in un cucciolo di lupo di 3 mesi.18 Entrambi questi rapporti hanno documentato antigene e sequenze genetiche di WNV, utilizzando rispettivamente IHC e RT-PCR, in più tessuti extraneurali associati a lesioni di necrosi e infiammazione.

Questo rapporto documenta un caso di grave malattia neurologica in un giovane cane adulto con una durata di 2 settimane di segni del SNC, in cui la prova di infezione da WNV era limitata al cervello. Le lesioni istologiche nel cervello erano aspecifiche ma compatibili con i risultati di encefalite WNV riportati nei cavalli,8 nell’uomo,20 e le due segnalazioni nei cani,6,18 sia per quanto riguarda la posizione (tronco cerebrale e midollo) che il tipo (encefalite non suppurativa con aree di necrosi). I segni clinici di perdita di equilibrio (rotolamento) e atassia sarebbero compatibili con la malattia cerebellomedullare, mentre i tremori di tutto il corpo suggeriscono un disturbo più diffuso del cervello. La prova di meningoencefalite è stata trovata nel lobo piriforme e nell’ippocampo, nel tronco cerebrale e nel cervelletto/midollo, ma ha risparmiato gran parte del prosencefalo. La necrosi epatica in questo caso senza evidenza di replicazione virale locale (PCR e IHC negativi) era probabilmente dovuta alla grave ipertermia ricorrente. Il danno epatico dovuto alla precedente replicazione virale che è stata eliminata durante la malattia non può essere escluso sebbene non sia stata riscontrata alcuna infiammazione. Numerosi epatociti binucleati hanno suggerito danni subacuti con rigenerazione. La presenza di lievito Candida nello stomaco è stata considerata una scoperta accidentale attribuibile al trattamento con antibiotici. In contrasto con i risultati di Buckweitz et al.6 e Lichtensteiger et al., 18 nessuna lesione, acidi nucleici virali, o antigene virale sono stati rilevati in tutti i tessuti extraneurali compreso congelato e rene fisso e fegato da questo cane.

L’area di necrosi riscontrata nel tronco cerebrale di questo cane è stata associata ad una risposta macrofagica localizzata (cellule gitter) ma non ad un infiltrato infiammatorio locale palese, suggerendo,come descritto nei cavalli, 8 che la lesione può avere un’eziologia vascolare o possibilmente immuno-mediata piuttosto che un’eziologia citolitica o infiammatoria diretta. IHC per WNV sul cervello non è stato in grado di dimostrare in modo convincente l’antigene virale in questo caso e nel caso riportato da Buckweitz et al., 6 indicando livelli inferiori di replicazione virale rispetto a quelli osservati nei tessuti aviari, di nuovo simili ai risultati nei cavalli.12 Lichtensteiger et al.18 non ha riportato IHC del cervello.

Il tasso relativamente più elevato di malattia neurologica osservato nelle infezioni equine con il ceppo statunitense di WNV rispetto a quelli in Italia8 è supportato da studi sperimentali nei topi, che indicano che il ceppo statunitense è altamente neuroinvasivo rispetto ad altri ceppi.3 Ulteriori studi sui topi hanno dimostrato che l’esposizione ad anestetici gassosi e CO2 aumenta la neuroinvasione WNV in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo,4,13 suggerendo che altri fattori ambientali o ospiti possono influenzare lo sviluppo della malattia neurologica negli animali. La bassa incidenza della malattia clinica osservata nei cani a fronte di un’elevata sieroprevalenza suggerisce che i cani sono più resistenti alla neuroinvasione rispetto agli esseri umani o ai cavalli.

La prova dell’infezione extraneurale non è stata trovata in cavalli con encefalomielite WNV8 come in questo cane. Forse, in questo Terrier maltese la risposta immunitaria aveva eliminato il virus dai tessuti extraneurali. La presenza di abbondante replicazione virale nei tessuti extraneurali nelle altre due segnalazioni di infezioni canine statunitensi suggerisce che una certa replicazione virale si verifica nei tessuti extraneurali prima della neuroinvasione e che il rene e il cuore sono probabilmente tessuti bersaglio nel cane. Buckweitz et al.6 suggeriscono biopsia renale per la diagnosi di infezione da WNV nei cani, ma Lichtensteiger et al.18 non ha trovato antigene virale nel rene del cane che hanno esaminato. Il valore clinico della biopsia renale18 o anche del test delle urine per WNV, presumibilmente utilizzando RT-PCR, non è stato ancora valutato criticamente.

La replicazione extraneurale di WNV nell’uomo può essere estrapolata da segnalazioni di encefalite fatale in riceventi di reni da donatori infetti che hanno avuto inizio 13-18 giorni dopo il trapianto e da encefalite grave in un ricevente di cuore,9,11 indicando che la malattia può essere trasmessa attraverso il trapianto di sangue o di organi. Ulteriori prove di robusta replicazione del WNV nei tessuti extraneurali dei mammiferi sono presentate in un recente rapporto che documenta l’infezione da WNV fatale in tre scoiattoli di volpe orientale, con evidenza di replicazione virale renale, cerebrale, cardiaca, epatica e polmonare.14 Ulteriori studi sono necessari per chiarire i dettagli della biologia e della fisiopatologia delle infezioni da WNV nei mammiferi.

Il continuo significato di WNV per la salute animale e umana in questo paese probabilmente comporterà il virus che diventa endemico con epidemie sporadiche. Le agenzie di sanità pubblica spesso forniscono informazioni tempestive sui focolai di malattie umane. È possibile che l’analisi degli anticorpi anti WNV nei sieri canini e felini possa fornire preziose informazioni epidemiologiche sulla diffusione e l’incidenza di WNV.