basato sull’espressione Genica di deconvoluzione di campioni di tessuto adiposo mediante l’AT21 firma matrice

Il AT21 firma matrice è stato sviluppato con l’obiettivo di determinare la composizione cellulare di campioni di tessuto adiposo. È costituito da profili di espressione specifici del tipo cellulare di 1872 sonde microarray da 21 tipi di cellule. Le sonde 1872 sono state selezionate per ottimizzare la capacità della matrice di firma di distinguere tra diversi tipi di cellule, che si riflette riducendo al minimo la sovrapposizione di informazioni tra tipi di cellule (implementata tramite una minimizzazione del numero di condizioni, vedere Metodi supplementari).

In Fig. 2A mostriamo le correlazioni di firme tra i diversi tipi di cellule, rivelando alte correlazioni tra tipi di cellule correlate, come adipociti sottocutanei e pericardici, o cellule staminali/stromali mesenchimali, condrociti, osteoblasti e cellule staminali/stromali adipose (ASCs). Alla luce di queste alte correlazioni tra alcuni tipi di cellule, abbiamo deciso di indagare la capacità del nostro approccio di distinguere tra tipi di cellule simili con le seguenti due strategie. Innanzitutto, applichiamo l’approccio deconvoluzione al set di dati di riferimento stesso, risultando in una chiara distinzione tra tipi di celle (Fig. 3A) come controllo positivo, per dimostrare che il metodo proposto può effettivamente identificare chiaramente le firme di cellule pure dal set di dati di riferimento. Mostriamo anche nella stessa figura (Fig. 3B, C) l’espressione normalizzata dei marcatori convenzionali e dei marcatori primari previsti da CellMaDe per il confronto dai tipi di celle nel set di dati di riferimento. La figura mostra il confronto in termini di espressione normalizzata specifica del tipo di cella di marcatori convenzionali vs marcatori previsti CellMaDe per ogni tipo di cella. In secondo luogo, eseguiamo l’analisi di deconvoluzione con una serie di campioni di tessuto adiposo 779 (Dati supplementari S2) da quattro diversi depositi di tessuto adiposo (SAT, OAT, PAT e EAT) e controlliamo quanto bene i risultati concordino con il corpo della letteratura. Questa seconda analisi mostra che si prevede che i campioni di tessuto adiposo abbiano in media il 14,5% di ASCs, mentre la somma dei tre tipi di cellule correlate (cellule staminali mesenchimali/stromali, osteoblasti e condrociti) è inferiore all ‘ 1% in media, rivelando la nostra capacità di distinguere correttamente tra questi tipi di cellule (Fig. S4). Inoltre, il 95% dei campioni SAT ha un punteggio adipocitario pericardico dello 0% e un punteggio adipocitario sottocutaneo medio del 74%, mentre i campioni OAT, EAT e PAT sono per lo più predetti per avere più adipociti pericardici rispetto agli adipociti sottocutanei, sebbene la distinzione sia meno chiara. Ciò rivela la chiara differenza tra adipociti sottocutanei e adipociti da altri depositi adiposi in prossimità di organi interni, che possono essere rilevati dalla metodologia proposta.

Tipo di Cella Specificità di TissueDecoder: Heatmaps di AT21 firma matrice che mostra (A) tipo di cella composizione di stima da CIBERSORT con AT21 firma matrice, (B) l’espressione normalizzata selezionati marcatori convenzionali dalla letteratura e (C) il normalizzata con l’espressione di CellMaDe predetto primaria marcatori. Lo xaxis comune sopra la figura indica i campioni utilizzati per annotare i tipi di celle dalla matrice di firma AT21. CellMaDe e CIBERSORT sono entrambi addestrati con la matrice di firma AT21, quindi (A, C) sono risultati ottimali per entrambe le tecniche mentre (B) rappresenta il potere di separazione dei marcatori convenzionali sulla matrice di firma AT21. Le caselle verdi indicano per ogni tipo di cella (colonne) la riga con il relativo indicatore corrispondente.

Accanto a queste valutazioni, abbiamo utilizzato un set di dati di convalida multipiattaforma indipendente (diverse piattaforme Affymetrix microarray) per testare la deconvoluzione basata su CIBERSORT con la matrice di firma AT21, dimostrando che il nostro approccio fornisce correttamente le percentuali più alte per il rispettivo tipo di cella isolata per tutti i tipi di cella testati nel set di S1C).

Le percentuali medie stimate del tipo di cellula isolata sono 69,2% per gli adipociti sottocutanei, 57,1% per le ASCs, 89,9% per le cellule B, 84.8% per le cellule T CD4+, 71,0% per le cellule T CD8+, 62,0% per le cellule NK e 90,5% per i monociti. Si prevede che la frazione CD14+ del tessuto adiposo (monociti/macrofagi) consista principalmente di macrofagi (25,4%), cellule dendritiche mieloidi (24,4%) e monociti (18,1%). La deviazione dai risultati ottimali in base ai dati di riferimento stessi (Fig. 3A) può essere spiegato da differenze multipiattaforma tra i set di dati di convalida e di riferimento (il set di dati di convalida e il set di dati di riferimento sono stati ibridati in due diversi microarray Affymetrix).

Marcatori primari e secondari CellMaDe

Successivamente, caratterizziamo ulteriormente la matrice di firma studiando quali geni sono incorporati in essa e confrontando la loro specificità di tipo cellulare con quella dei marcatori di tipo cellulare usati convenzionalmente utilizzando i criteri di marcatore primario e secondario (Eqs. 1 e 2 nella sezione metodi). Ciò ha portato a una classifica di tutte le sonde presenti sull’array in base ai loro punteggi di criterio primario e secondario. In Fig. 2B, mostriamo i primi 10 geni con il più alto punteggio di criterio primario e secondario da quattro tipi di cellule – vale a dire ASCs, cellule T CD8+, macrofagi e adipociti sottocutanei-e indicano la loro posizione cellulare secondo i termini di ontologia genica (per tutti i 21 tipi di cellule vedi Fig. S2, Dati supplementari S3). Tutti i geni presenti nella matrice di firma AT21 sono contrassegnati in grassetto, mostrando che l’algoritmo CIBERSORT seleziona principalmente una combinazione di marcatori secondari (il criterio di selezione del gene di CIBERSORT è paragonabile al nostro criterio di marcatore secondario), mentre i marcatori primari e i marcatori convenzionali non sono sempre inclusi nella matrice di firma.

Questo è in contrasto con gli approcci classici basati su marcatori come l’immunoistochimica, che si basano fortemente sulla specificità del tipo cellulare di un singolo marcatore (primario). Tuttavia, i marcatori convenzionali come CD68 per i macrofagi sono espressi anche in altri tipi di cellule, come i monociti, le cellule dendritiche plasmacitoide10, e in misura minore anche nei fibroblasti e nelle cellule endoteliali11,12, che è anche indicato dal suo punteggio di criterio primario relativamente basso (Fig. 2 TER). Pertanto, proponiamo i marcatori primari identificati da CellMaDe per essere ulteriormente confermati sperimentalmente prima di essere chiariti come marcatori alternativi per i tipi di cellule all’interno del tessuto adiposo.

Per le cellule T CD8+, il marcatore usato convenzionalmente (Cluster di differenziazione 8B; CD8B) è identificato come il marcatore primario più forte, il che non è stato molto sorprendente. Tuttavia, il cluster di differenziazione 4 (CD4) non è molto specifico per le cellule T CD4+, come dimostrato dalla sua espressione prevalente in altri tipi di cellule ematopoietiche come monociti o macrofagi (Fig. 3B, Fig. supplementare S2). Questo è anche il motivo per cui nella citometria a flusso, CD4 viene utilizzato solo dopo l’identificazione della popolazione di cellule CD3+ (cellule T) per identificare le cellule T CD4+. Il Dendrocyte ha espresso sette proteine transmembrana (DCSTAMP) è identificato come un marker primario molto specifico per i macrofagi secondo la nostra analisi. In Fig. 3C osserviamo che l’alta espressione di DCSTAMP è limitata a un sottoinsieme dei campioni di macrofagi, il che potrebbe evidenziare la sua specificità a un sottoinsieme di macrofagi, ad esempio cellule giganti di macrofagi, come suggerito da studi precedenti13. Per ASCs il marcatore primario identificato EEA1 non è molto sorprendente. Per questo tipo di cellule, suggeriamo di utilizzare una combinazione di marcatori secondari implementati nelle strategie di gating della citometria a flusso e nell’algoritmo CIBERSORT.

Il caso degli adipociti sottocutanei sembra essere simile in quanto anche il marcatore primario CMA1 non è molto sorprendente. Ciò può tuttavia essere attribuito al fatto che anche gli adipociti pericardici fanno parte della matrice di riferimento. Quindi il criterio primario in questo caso non si concentra solo sulla distinzione degli adipociti da altri tipi di cellule, ma anche sulla distinzione degli adipociti da due diversi depositi. Pertanto, abbiamo incluso un’analisi aggiuntiva unendo tutti gli adipociti nella matrice di riferimento insieme per determinare i marcatori primari per gli adipociti. I primi tre marcatori primari identificati per gli adipociti in questa analisi sono stati SPARCL1, ADIPOQ e THRSP.

Per un’ulteriore valutazione dei principali marcatori primari identificati, abbiamo confrontato la loro espressione in un set di dati indipendente più ampio composto da 394 profili di espressione tissutale annotati anatomicamente (Fig. S3, Metodi supplementari). Sei dei 21 marcatori primari sono completamente convalidati, definiti come mostrando la più alta espressione nel tipo di cellula proposto, vale a dire CALCRL per le cellule endoteliali, SPTA1 per gli eritroblasti, CD8B per le cellule T CD8+, MS4A1 per le cellule B, PRSS33 per gli eosinofili e DCSTAMP per i macrofagi. Dodici marcatori sono parzialmente convalidati, identificati come tra i primi cinque dei 394 profili di espressione tissutale annotati anatomicamente o espressi a un livello superiore solo in tipi di cellule che non sono correlati al tessuto adiposo, come miociti o neuroni. Solo tre marcatori non sono stati convalidati, vale a dire EEA1 per ASCs, RGS5 per le cellule muscolari lisce e PF4V1 per le piastrine, quest’ultimo a causa dell’assenza di piastrine nel set di dati di convalida per PF4V1, impedendo la sua corretta valutazione.

Infine, abbiamo utilizzato il set di dati di convalida indipendente per valutare il potere discriminatorio dei principali marcatori primari identificati. I risultati di questa analisi sono presentati in Fig. S1 e Dati supplementari S2, che mostrano che i marcatori primari sono espressi e in grado di distinguere tra tipi di cellule nel set di dati di validazione, ad eccezione di CMA1 per adipociti sottocutanei e EEA1 per ASCs (Fig. S1B).

Contestualizzazione dei risultati – una revisione della letteratura

Come fase successiva della valutazione, abbiamo compilato rapporti quantitativi di letteratura sulla composizione del tipo di cellula del tessuto adiposo umano per confrontare le stime del nostro approccio di deconvoluzione per 1119 campioni SAT (616 microarray e 503 set di dati RNA-Seq) e 51 campioni OAT con le percentuali riportate in letteratura.

Per prima cosa, abbiamo cercato qualsiasi rapporto in letteratura che quantificasse la percentuale di adipociti nel tessuto adiposo. Questa ricerca ha rivelato una serie di stime da ~93% 14, ~70% 15,16 e ~15% 17, che possono potenzialmente essere spiegate da differenze nell’elaborazione del campione (ad esempio rimozione dei vasi sanguigni) e metodi di conteggio (ad esempio istologia vs. isolamento cellulare, diversi marcatori). Molto recentemente, Glastonbury e colleghi hanno stimato la frazione adipocitaria in due set di dati di RNA-Seq del tessuto adiposo sottocutaneo a livello di popolazione (TwinsUK, n = 766 e il Genotipo-Tissue Expression project, n = 326) stimando le proporzioni relative di quattro tipi di cellule distinte (adipociti, macrofagi, cellule T CD4 + e cellule endoteliali micro-vascolari). La loro stima per la percentuale mediana degli adipociti è 62% per GTEx e 82% TwinsUK study18.

Successivamente, ci siamo concentrati sugli studi che determinano le frazioni di non adipociti19 e abbiamo incluso 25 studi originali nella nostra recensione. I risultati quantitativi delle frazioni cellulari estratte da questi studi sono presentati in Fig. 4 e Dati supplementari S4 (vedere Metodi supplementari per i dettagli metodologici). La conta cellulare riportata per i macrofagi varia notevolmente, da una conta media inferiore all ‘ 1% delle cellule totali in alcuni studi fino a una media del 27% delle cellule totali in un altro studio. Queste differenze piuttosto grandi tra gli studi possono sorgere a causa di diversi fattori, tra cui (i) differenze biologiche effettive tra i campioni analizzati, (ii) arricchimento locale dei macrofagi (ad es. in strutture simili a corone) che influenzano in modo specifico i risultati con bassi conteggi di cellule totali come l’immunoistochimica, (iii) differenze tecniche tra le metodologie e i marcatori utilizzati e (iv) differenze nei protocolli di gestione e analisi dei campioni (ad esempio tagli di fluorescenza, anticorpi utilizzati). È importante notare che in particolare, alcuni studi di immunoistochimica riportano numeri di macrofagi molto alti (Fig. 4 BIS). Inoltre, ci possono essere alcune differenze dovute alle unità segnalate tra diversi studi, in quanto i due studi con percentuali di macrofagi più alte (medie di macrofagi 27% e 26%) sono gli unici a riportare “macrofagi per numero totale di nuclei”. Abbiamo dimostrato in precedenza che gli studi di immunoistochimica da fette di tessuto possono essere distorti a causa della dipendenza da osservazioni da sezioni trasversali (fette di tessuto sottile)20. Pertanto, si può sostenere che specificamente per gli adipociti la sezione trasversale può coprire parti della goccia lipidica, ma non il nucleo, con conseguenti differenze sistematiche tra le metodologie di conteggio.

Recensione di Tessuto Adiposo Cellulare Composizione: revisione della Letteratura di segnalazioni di tessuto adiposo composizione cellulare in confronto dei nostri risultati utilizzando CIBERSORT (in verde). Viene mostrata la percentuale media (punti), minima e massima (frecce) delle cellule totali (calcolate secondo ipotesi e formule indicate nei metodi supplementari) per cinque diversi tipi di cellule: macrofagi (A), ASCs (B), cellule T CD4+ (C), cellule T CD8+ (D) e cellule endoteliali (E). Il colore specifica il metodo utilizzato per il conteggio delle celle come indicato nella legenda. I punti grigi e le frecce in (A) sono i nostri risultati in cui il punteggio dei macrofagi e il punteggio dei monociti sono stati aggiunti insieme. È indicato come confronto, poiché i marcatori dei macrofagi CD68, HAM56 e CD14 macchiano anche i monociti. Il punto grigio in (B) rappresenta la somma delle “cellule stromali sopraavventiziali-adipose” (punto nero nella stessa riga) e delle “cellule progenitrici endoteliali”, che sono state distinte nel rispettivo studio, ma sono probabilmente entrambe coperte dal punteggio “staminali adipose/cellule stromali” dalla nostra matrice di firma AT21. Sul lato sinistro di ogni grafico sono indicati i riferimenti agli studi da cui sono stati prelevati i risultati (vedi Dati supplementari S4) e i marcatori utilizzati. Per le ASCs e le cellule endoteliali è stata utilizzata una combinazione di marcatori (vedere Dati supplementari S4). Una stella allegata alla lettera di riferimento dello studio indica che il partecipante allo studio aveva un indice di massa corporea medio superiore a 35. È incluso nella figura poiché è stato riportato che la frequenza dei macrofagi è aumentata nelle persone con obesità grave.

al fine di valutare la potenziale influenza delle differenze biologiche tra i partecipanti allo studio, soprattutto per quanto riguarda il loro stato di obesità, abbiamo segnato tutti gli studi che coinvolgono le persone con un indice medio di massa corporea superiore a 35 (obesità grave) con una stella (Fig. 4 BIS). La relazione tra lo stato di obesità e la conta dei macrofagi è stata studiata in diversi articoli, riportando un aumento della conta dei macrofagi con aumento dell’obesità in alcuni, ma non in tutti gli studi21,22,23,24,25,26. Tuttavia, lo stato di obesità non può spiegare la diversità osservata tra le percentuali di macrofagi riportate nella nostra revisione della letteratura (Fig. 4 BIS).

Per confronto, abbiamo valutato le differenze inter-studio nelle nostre analisi (solo SAT), mostrando risultati relativamente stabili, il che indica una migliore standardizzazione nonostante le differenze biologiche dei partecipanti allo studio e le potenziali differenze nella gestione dei campioni tra i diversi laboratori (Fig. S5). Anche l’utilizzo di dati a livello di RNA-Seq per eseguire la deconvoluzione ha comportato una varianza inferiore rispetto agli studi riportati dalla letteratura (Fig. 4, Fig.supplementare. S6).

Rispetto ai rapporti di letteratura, la quantità stimata di macrofagi dalla nostra analisi è all’estremità inferiore dello spettro, con una media dell ‘1,3% delle cellule totali per i 616 campioni SAT (mediana dello 0,8%, IQR: 0,03% -1,8%) e dell’ 1,2% delle cellule totali per i 51 campioni OAT (mediana dell ‘ 1,2%, IQR: 0,4% -1,8%). Osservando gli estremi, i nostri risultati confermano che esiste una vasta gamma di composizione dei macrofagi con macrofagi fino al 25% in casi molto rari.

Al fine di tenere conto della potenziale influenza dei monociti, che esprimono anche i marcatori utilizzati negli studi di letteratura (CD14, CD68 e HAM56), riportiamo anche le frazioni combinate di macrofagi e monociti dal nostro approccio AT21-CIBERSORT. Ciò equivale a una media dell ‘ 1,5% di macrofagi/monociti nei campioni SAT e del 4,3% di macrofagi/monociti nei campioni OAT, il che porta le nostre stime in prossimità dei valori medi riportati in letteratura.

La quantità di ASCs (media del 14,8% in SAT e del 15,7% in OAT), cellule T CD4+ (media dello 0,9% in SAT e 0.4% in OAT), cellule T CD8+ (media dello 0,5% sia in SAT che in OAT) e cellule endoteliali (media dello 0,7% in SAT e dell ‘ 1,8% in OAT) stimate dal nostro approccio è ben in linea con i rapporti della letteratura (Fig. 4 TER-E). Simile ai macrofagi, i rapporti della letteratura sulle quantità di ASC mostrano grandi variazioni (Fig. 4 TER). Abbiamo identificato tre ragioni che spiegano questa variazione. In primo luogo, tre studi di letteratura (studi s, t e v – vedi Dati supplementari S4) utilizzano il tessuto adiposo dagli aspirati di liposuzione, che è contaminato con il sangue17, con conseguente frazioni relative inferiori di ASCs nella SVF. In secondo luogo, alcuni studi distinguono tra progenitori endoteliali e cellule staminali adipose sopraavventiziali (ad esempio studi u e v), mentre altri (incluso il nostro studio) non lo fanno, probabilmente contando entrambe le sottopopolazioni come ASCs. In particolare, quando si sommano le due sottopopolazioni nello studio di Zimmerlin27, la frazione media risultante del 13,9% (punto grigio in Fig. 4B) è vicino ai nostri risultati stimati. In terzo luogo,la resa totale delle cellule e la percentuale di cellule staminali/stromali variano ampiamente a seconda del metodo utilizzato per l’isolamento di SVF28, 29, che può potenzialmente spiegare i numeri molto bassi riportati da Viardot e colleghi30 (studio m).

Ci sono diversi tipi di cellule come le cellule dendritiche plasmacitoidi, neutrofili o eosinofili per i quali non siamo riusciti a trovare alcun risultato in letteratura e quindi stiamo segnalando la loro frequenza nel tessuto adiposo umano per la prima volta. Alcuni tipi di cellule come piastrine ed eritroblasti sono principalmente inclusi come controllo nella matrice di firma AT21, consentendo l’identificazione della presenza di sangue all’interno dei campioni.

Set di dati di riferimento con tipi di cellule isolate dal tessuto adiposo

Per un’ulteriore verifica dei risultati della deconvoluzione AT21, li abbiamo confrontati con la deconvoluzione basata sulla matrice di firma AT4 costituita da quattro frazioni cellulari isolate dal tessuto adiposo.

Al fine di escludere differenze nella popolazione dello studio e nelle procedure di campionamento dei tessuti (mantenendo le differenze nella granularità del tipo cellulare, nei campioni di riferimento e nell’esecuzione di analisi multipiattaforma) abbiamo utilizzato il riferimento ex-vivo per deconvolgere i 779 campioni di tessuto adiposo dell’array Affymetrix Human U133 Plus 2.0 che abbiamo analizzato con la nostra matrice di firma AT21 Le percentuali di cella risultanti (Fig. S7) sono in un intervallo simile a quello dei risultati ottenuti usando AT21 come riferimento (sebbene le percentuali di monociti / macrofagi siano un po ‘ più alte) e si correlano ragionevolmente bene con loro, rivelando correlazioni Spearman e Pearson tra 0.41 e 0.87 (Fig. S8). Tuttavia, la nostra analisi dimostra che la scelta dei tipi di cellule e la loro origine può avere un potenziale impatto sul livello di dettaglio nei risultati, sebbene la distribuzione complessiva sia conservata.

Per un’ulteriore valutazione del nostro approccio di deconvoluzione, abbiamo usato questo ‘riferimento ex-vivo’ per deconvolvere campioni costituiti dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo (anche dal set di dati GSE80654), rivelando una distribuzione di tipo cellulare di 53% cellule staminali/stromali, 27% monociti/macrofagi, 19% altri leucociti e 1% adipociti in media (vedi Fig. S9) da n = 6 individui su un totale di n = 10. I dati per le restanti quattro persone non erano disponibili. I risultati della citometria a flusso hanno riportato medie leggermente diverse di 62% cellule staminali/stromali, 13% monociti/macrofagi, 12% altri leucociti, 3% cellule endoteliali, ~10% non specificato), nonostante provengano dalla dimensione del campione più grande di n = 10 individui nello studio originale31. Entrambi i risultati confermano l’elevata quantità di cellule staminali/cellule stromali nel tessuto adiposo e (dopo la conversione di unità da cellule in SVF di cellule nel tessuto adiposo – vedi metodi) sono ragionevolmente simili ai nostri risultati medi applicazione AT21 al tessuto adiposo, quando si considerano le differenze nella popolazione in studio, tessuto adiposo metodologie di campionamento, e la granularità del tipo di cellula distinzione (4 vs. 21 tipi di cellule).

Confronto di quattro depositi di tessuto adiposo

Successivamente, confrontiamo la composizione di tipo cellulare di quattro depositi di tessuto adiposo (SAT, OAT, PAT e EAT) riportando la loro composizione media di tipo cellulare (Fig. 5, dettagliato in Fig.supplementare. S4). Ciò indica che SAT ha la più alta percentuale di adipociti (74%) seguita da OAT (66,4%), EAT (59,5%) e PAT (59,4%), mentre EAT e PAT hanno molte più cellule immunitarie (20,8% e 20,9%, rispettivamente) rispetto a OAT (9,8%) e SAT (7,4%). Inoltre, l’AVENA è la fonte più ricca di cellule staminali / stromali (17,2% rispetto al 14,9% per SAT, 14.1% per MANGIARE e 12,4% per PAT).

Percentuale Stimata di Tipi di Cellule per Adiposo di Deposito: (A) grafico a Torta che mostra il generale tipo di cella distribuzione di vari depositi di tessuto adiposo (Sottocutaneo – n = 616, Omentale – n = 51, Pericardico – n = 66, ed Epicardici – n = 46) in termini di quattro archetipi di cellule nel tessuto adiposo (cellule del sistema Immunitario, cellule Staminali/cellule stromali, Adipociti, e altri). B) Grafici a barre che mostrano la distribuzione dettagliata del compartimento delle cellule immunitarie da ciascun deposito di tessuto adiposo. Tutti i valori sono medie dei campioni analizzati dal rispettivo deposito.

Questi risultati devono essere interpretati con cura a causa delle differenze nel numero e nelle caratteristiche delle persone da cui sono stati raccolti i campioni. L’accesso a EAT e PAT è fortemente limitato a causa della loro posizione fisiologica e della natura invasiva della procedura di campionamento. Pertanto i campioni PAT sono stati prelevati da 66 pazienti (età: 66 ± 8 anni) con malattia coronarica (CAD)32 e i campioni EAT sono stati prelevati da 11 neonati (da 6 a 24 giorni), 28 neonati (da 40 giorni a 1 anno) e 7 bambini (da 2 a 7 anni) con cardiopatia congenita (CHD)33.

Nonostante le differenze nell’età dei donatori EAT e PAT, la composizione dell’archetipo delle cellule immunitarie in EAT e PAT è notevolmente simile l’una all’altra pur essendo molto diversa dai campioni SAT e OAT. Ciò indica la robustezza dei nostri risultati e la natura conservata della composizione del tipo cellulare in questi due depositi di tessuto adiposo che circondano il cuore.

Inoltre, riportiamo le frazioni di cellule immunitarie “adattive” classicamente designate, incluse le cellule B, le cellule T CD8+ e CD4+, infiltrate in EAT e PAT. Queste cellule immunitarie adattive sono arricchite in EAT e PAT, (più alte in PAT che in EAT) rispetto ai depositi SAT e OAT, che potrebbero essere probabilmente dovuti all’origine dei campioni analizzati da pazienti con CAD o CHD, come riportato in precedenza per le cellule T CD8 +34. La nostra scoperta è supportata anche da Mazurek e colleghi35, che hanno confrontato l’espressione di citochine sia in EAT che in SAT in pazienti sottoposti a innesto di bypass coronarico e hanno scoperto che EAT è una fonte di diversi mediatori infiammatori.

Un confronto più dettagliato di SAT e OAT è stato eseguito sullo studio di Hardy et al. 2011 (dataset GSE20950), in cui entrambi i depositi erano disponibili presso gli stessi individui25. Questa analisi ha rivelato un aumento del contenuto di neutrofili in SAT (anche dopo la correzione per test multipli) e un aumento del contenuto di cellule staminali/stromali mesenchimali e cellule muscolari lisce in OAT (Fig. 6 BIS). Lo studio dei marcatori derivati da CellMaDe per neutrofili (CYP4F3) e per adipociti pericardici (C7) e adipociti sottocutanei (CMA1) ha confermato la differenza significativa tra SAT e OAT in questi tipi di cellule (anche dopo aggiustamento per test multipli).

Tessuto Adiposo Composizione Attraverso Tratti Fenotipici: (A) Heatmap mostrando significativi sopra (rosso)/under (blu) rappresentato tipo di cellula in diverse categorie in base alla z-score (indica il numero di deviazioni standard di ogni gruppo è lontano dalle altre). Solo i risultati significativi (non corretti p < 0.05) sono colorati. Le stelle etichettano i risultati che rimangono significativi dopo la correzione per test multipli. I diagrammi del fagiolo che mostrano (B) tutti i tipi significativi delle cellule e (C) ASCs e adipocytes sottocutanei (non individuati come significativi), per il gemello più pesante vs più magro, studio discordante. L’asse y descrive le differenze nelle frazioni di cella stimate tra il gemello più pesante e più magro all’interno di una coppia di gemelli.

Composizione di tipo cellulare tra tratti fenotipici

Infine, abbiamo confrontato la composizione di tipo cellulare del tessuto adiposo tra individui con diversi tratti fenotipici, come sesso diverso, età, indice di massa corporea (BMI) e diverse fasi dello sviluppo del diabete di tipo 2. Inoltre, abbiamo incluso studi di intervento che studiano l’effetto della restrizione calorica o dell’ingestione di resveratrolo sulla composizione del tipo di cellula SAT. I risultati di queste analisi sono mostrati in Fig. 6 e più in dettaglio in Fig.supplementare. S10 e Dati supplementari S5.

Abbiamo rilevato differenze significative nella composizione delle cellule SAT tra maschi e femmine, indicando che ci sono quantità più elevate di cellule dendritiche plasmacitoidi, cellule T CD4+, piastrine e condrociti nelle femmine, mentre i maschi hanno più cellule T CD8+, fibroblasti e cellule endoteliali. In particolare, le differenze nelle cellule T CD4+ e CD8+ erano significative anche dopo la correzione per test multipli, ma non sono state rilevate sulla base di marcatori singoli stabiliti o derivati da cellule. Per quanto riguarda l’età, abbiamo rilevato solo un risultato significativo, che indica una maggiore quantità di fibroblasti con l’aumentare dell’età.

Ci sono quattro comparazioni relative al BMI, ovvero (i) da un rapporto continuativo di BMI con cella frazioni in SAT, (ii) un confronto di SAT composizione cellulare in gemelli monozigoti concordanti (più pesante contro magri doppia, ∆BMI < 3 kg/m2), (iii) la stessa in gemelli monozigoti discordanti (più pesante contro magri doppia, ∆BMI > 3 kg/m2), e (iv) un confronto di AVENA composizione cellulare obesi vs magra bambini. Il primo confronto indica che il BMI è correlato positivamente con la quantità di monociti, cellule dendritiche mieloidi, piastrine, osteoblasti, condrociti e ASCs in SAT, mentre la correlazione con gli adipociti sottocutanei è negativa. Non vengono rilevate differenze significative tra gemelli concordanti, mentre i gemelli discordanti differiscono significativamente nella quantità di cellule T CD4+, eritroblasti, osteoblasti (tutti più alti nei gemelli più pesanti), così come le cellule B (più alte nei gemelli più magri) (Fig. 6 TER). In particolare, c’è una tendenza verso una maggiore quantità di ASCs e minori quantità di adipociti nei gemelli più pesanti (Fig. 6C), sostenendo il rispettivo risultato significativo nell’associazione continua con BMI. Al contrario, alcuni altri risultati dell’associazione continua con BMI non sono rilevati nello studio gemello, che può essere attribuito a potenziali effetti confondenti (età, sesso o altri fattori) nell’associazione continua.

La mancanza di risultati significativi nel confronto tra lean vs. i bambini obesi sono principalmente dovuti alla potenza limitata poiché lo studio coinvolge solo un totale di campioni 11 (5 obesi e bambini magri 6).

Abbiamo fatto sei confronti relativi al diabete, alla tolleranza al glucosio o alla resistenza all’insulina. Tre di loro (alterata tolleranza al glucosio vs. normale tolleranza al glucosio in SAT; diabete mellito vs. alterata tolleranza al glucosio in SAT; e insulino-resistente vs. sensibile in OAT) non ha mostrato alcun risultato statisticamente significativo. Il confronto della composizione del tipo di cellule SAT in insulino-resistente vs. gli individui sensibili hanno rivelato un aumento significativo delle cellule muscolari lisce in individui resistenti all’insulina. Il SAT delle persone con diabete mellito contiene più monociti e meno eosinofili rispetto a quello delle normali persone tolleranti al glucosio, secondo la nostra analisi, mentre l’OAT delle persone morbosamente obese mostra differenze nelle cellule dendritiche mieloidi, eosinofili (entrambi più alti nelle persone con diabete) e condrociti (più alti nelle persone senza diabete).

Non abbiamo trovato alcuna prova che la restrizione calorica o la supplementazione di resveratrolo cambi significativamente la composizione del tipo di cellula del tessuto adiposo.

È interessante notare che uno studio incluso riporta anche percentuali di macrofagi determinate da immunoistochimica25 (GSE20950). Mostrano frequenze di macrofagi per campioni di AVENA 11 (su partecipanti allo studio 20) da persone insulino-sensibili e insulino-resistenti, con un contenuto medio di macrofagi di 1.8% (dopo la conversione di unità in % delle cellule totali), che corrisponde perfettamente alla nostra stima di 1.495% come media di tutti i 20 partecipanti (i criteri di selezione degli 11 campioni per l’immunoistochimica non sono stati inclusi nella descrizione dello studio). Inoltre riportano una significativa associazione tra HOMA-IR e contenuto di macrofagi in queste persone 11, che confermiamo parzialmente con significato borderline (valore p di 0.054) per un confronto tra persone insulino-resistenti e insulino-sensibili in tutti i partecipanti allo studio 20.