DESCRIZIONE E NOTE GENERALI

Restrizione endonucleasi (REs) sono enzimi batterici che fendono DNA a doppio filamento. Le RES di tipo I sono importanti nella funzione batterica ma non fendono il DNA in sequenze specifiche. Le RES di tipo II, descritte per l’uso in questo manuale, richiedono siti altamente specifici per la scissione del DNA e sono quindi strumenti estremamente utili in biologia molecolare. Questi enzimi consentono la clonazione e la purificazione di frammenti di DNA definiti. Le 500 RES conosciute sono tipicamente isolate da una varietà di ceppi batterici.

Le RES sono presenti nei batteri presumibilmente per distruggere il DNA da fonti estranee (ad esempio, infettando il batteriofago) scindendo il DNA estraneo in specifici siti di riconoscimento. Il DNA dei batteri ospiti è protetto dalla scissione perché i siti di riconoscimento specifici vengono modificati, di solito per metilazione in una delle basi del sito, rendendo il sito non più un substrato per la scissione. In pratica, le RES con diverse specificità del sito di riconoscimento sono state purificate da vari ceppi batterici e sono utilizzate dai biologi molecolari in condizioni definite per scindere il DNA purificato da fonti eucariotiche in frammenti definiti in una reazione in vitro. I batteri ospiti utilizzati per propagare il DNA clonato in laboratorio sono solitamente mutanti nei geni di restrizione dell’ospite (hsdR, hsdM o hsdS); quindi le loro attività enzimatiche intracellulari non distruggeranno le sequenze ricombinanti estranee.

Questi fini sono complementari (“sticky”) e può essere enzimaticamente ricollegato a qualsiasi altro EcoRI-generato termini, utilizzando la T4 DNA ligasi. Altre RES riconoscono sequenze diverse e creano fenditure uniche che danno origine ad altri termini definiti, alcuni dei quali hanno anche 5’ estremità sporgenti, 3’ estremità sporgenti o nessuna estremità sporgente (vedi Tabella 5.1). Ogni RE ha una sequenza specifica e un numero di nucleotidi necessari per creare il sito di riconoscimento. Alcune RES non richiedono un nucleotide specifico in ogni posizione del sito di riconoscimento. Ad esempio, in alcuni casi è sufficiente un nucleotide purinico (A o G) in una posizione definita. La frequenza con cui un RE taglierà il DNA è quindi correlata al numero di basi nelle sequenze di riconoscimento (se sono necessarie più basi, è possibile effettuare meno tagli) e alle basi specifiche in qualsiasi posizione.

Le RES sono utili perché la loro specificità e i termini legabili risultanti consentono la dissezione, l’analisi e la ristrutturazione del DNA in modo controllato, prevedibile e site-specific. Poiché sono enzimi, ognuno ha requisiti specifici per le condizioni che portano all’attività di scissione ottimale. Fortunatamente, molti sono attivi in condizioni simili, con la variabile primaria che è la forza ionica (cioè NaCl nel buffer). Le condizioni pratiche sono state definite empiricamente per l’utilizzo di ogni RE come strumento di ricerca.

La quantità di attività RE non è solitamente definita utilizzando la cinetica enzimatica classica. Piuttosto, l’attività RE è definita in termini pratici per l’uso in laboratorio. Un’unità (U) di attività per un RE è solitamente definita come la quantità di enzima che taglierà 1 µg in tutti i siti specifici in un campione di DNA (di solito batteriofago λ) in 1 ora a 37°C. L’attività effettiva raggiunta può essere diversa se sono presenti ulteriori siti di digestione. Ad esempio, se 1 U di un RE è sufficiente per tagliare completamente 1 µg di DNA del batteriofago λ in un sito in condizioni di analisi standard, potrebbe non essere in grado di tagliare completamente 1 µg di un campione di DNA che ha quattro siti per un RE o un campione che non è stato sufficientemente purificato.

Altri fattori riguardanti le condizioni di reazione influenzano anche l’attività RE. Questi includono la purezza del DNA, tampone, condizioni di temperatura, e il RE stesso. La metilazione del DNA, la proteina legata o l’eccessiva viscosità del DNA ad alto peso molecolare in soluzioni viscose possono ridurre l’efficienza di un RE digest. Il DNA da tagliare dovrebbe essere solitamente privo di impurità; L’estrazione di SS-fenolo / cloroformio e la precipitazione di etanolo (Sezione 20-1) rimuoveranno molte impurità interferenti. Al contrario, la maggior parte delle RES di solito non sono influenzate negativamente dall’RNA o dal DNA a filamento singolo. Pertanto, l’aggiunta di tRNA come coprecipitante può essere utile nel recupero di piccole quantità di DNA senza influenzare i successivi RE digerimenti.

La condizione tipica del test per una reazione RE contiene un tampone (10 mm Tris, pH 7,4 è comune), 10 mM Mg2+ ed è privo di concentrazioni sostanziali di agenti chelanti (il tampone TE contiene una quantità sufficientemente bassa di EDTA). I buffer RE contengono anche concentrazioni di sale adeguate per dare la forza ionica ottimale per ogni RE. In alcuni casi, vengono aggiunti BSA, DTT e spermidina per fornire un’attività enzimatica ottimale. Quattro buffer RE generalizzati possono soddisfare i requisiti per la maggior parte delle FER e la preparazione anticipata di 10 × stock di questi buffer è descritta di seguito. La maggior parte dei RE digest viene eseguita a 37°C, anche se ci sono alcune eccezioni, come il TaqI.

La maggior parte delle RES acquistate viene spedita con un buffer di stoccaggio appropriato, ma questo contiene 25-50% di glicerolo per evitare il congelamento durante la conservazione a -20°C. Concentrazioni di glicerolo superiori al 5% (vol / vol) nei test di RE digestione possono inibire l’attività di molte RES. Inoltre, alte concentrazioni di glicerolo durante la RE digestione possono rilassare la specificità della sequenza di alcune RES, con Ad esempio, questo fenomeno è visto con il RE EcoRI comunemente usato, dove l’attività spuria osservata in alcune condizioni è chiamata attività EcoRI* (stella). Per questi motivi, è importante rendere il volume della reazione di digestione RE abbastanza grande da comprendere almeno una diluizione 1: 10 del RE stesso (e quindi ridurre la concentrazione di glicerolo). Altri fattori, quali pH, etanolo, o concentrazione impropria del sale possono anche causare l’attività della stella o l’attività diminuita; così, l’aderenza attenta alle circostanze raccomandate è importante.

Alcune altre considerazioni sono utili quando si utilizza REs. Utilizzare una nuova punta di pipetta ogni volta che viene trasferito un RE. Le tracce di contaminante aggiunte allo stock RE possono impedirne l’ulteriore utilizzo e confondere i risultati ottenuti negli esperimenti successivi. Quando si ottimizzano le reazioni, è meglio aggiungere ulteriore RE che incubare per molto più tempo di 1 ora. Inoltre, come accennato in precedenza, l’attività enzimatica è definita solo per tagliare uno standard di DNA. Poiché il campione è generalmente molto diverso dallo standard, una buona guida è quella di utilizzare circa 2-3 U di RE per microgramma di DNA da tagliare, soprattutto quando si tenta di digerire un campione difficile. A volte può essere necessario titolare la quantità di RE necessaria per digerire un campione di DNA in modo appropriato.

Infine, se si devono utilizzare due RES, occorre prestare attenzione alle condizioni saline ottimali di ciascuna. Se entrambi richiedono lo stesso buffer, la digestione può essere eseguita simultaneamente o in sequenza. Se sono necessarie condizioni di sale diverse, il RE che richiede meno sale deve essere usato prima. Dopo l’incubazione regolare la condizione di sale, e digerire con il RE che richiedono alto sale. L’attività RE può essere rimossa dall’estrazione di SS-fenolo/cloroformio in tutti i casi. Alcuni RES sono termolabili e possono essere inattivati riscaldando a 70°C per 5 min. Questa proprietà, tuttavia, varia da un RE all’altro e dovrebbe essere verificata per ogni RE utilizzato.