8 Polimixine
Le polimixine sono una classe di decapeptidi ciclici cationici caratterizzati dalla presenza di cinque residui amminici caricati positivamente, da acido di-ammino butirrico (Dab), e una coda lipofila, come mostrato nella struttura della polimixina B1 (50). Dimostrano una potente attività contro i batteri Gram-negativi e sono stati usati clinicamente negli 1950, ma l’uso è stato limitato da segnalazioni di tossicità, in particolare nefrotossicità. Tuttavia negli ultimi dieci anni, con la crescente prevalenza di batteri Gram-negativi multi-resistenti ai farmaci, c’è stata una rinascita nell’uso delle polimixine come farmaci di ultima istanza .
Ci sono molti svantaggi nell’attuale terapia con polimixina. La preparazione più comune nell’uso clinico è il profarmaco della polimixina E (Colistina) (51) noto come CMS (Colistina metano solfonato), che è stato sviluppato negli anni ‘ 60 come forma di dosaggio meno tossica. Tuttavia, come profarmaco con cinque gruppi amminici sulfonilati, la farmacocinetica è complicata e non ben compresa. La polimixina B viene dosata come sale di solfato mediante infusione lenta per superare gli effetti tossicologici acuti, ma le preoccupazioni sulla nefrotossicità portano a un dosaggio non ottimale. Una polimixina di” seconda generazione ” con un indice terapeutico migliorato e un regime di dosaggio sviluppato con la moderna metodologia PK–PD sarebbero un’aggiunta vantaggiosa all’armatura contro le infezioni Gram-negative multi-resistenti ai farmaci.
La modalità di azione delle polimixine non è completamente compresa. Le polimixine si legano e interrompono il lipopolisaccaride caricato negativamente (LPS) della membrana esterna dei batteri Gram-negativi, consentendo il passaggio della polimixina (e di altri farmaci) nello spazio periplasmico. Sebbene le polimixine siano molecole anfifiliche cationiche, il legame e il riconoscimento alla membrana esterna sono specifici. La delezione della catena grasso-acilica e dell’amminoacido 1 conduce al nonapeptide della polimixina B (PMBN, (52)), che sebbene significativamente meno attivo della polimixina B, mantiene la capacità di permeabilizzare la membrana esterna dei batteri Gram-negativi. L’enantiomero di PMBN, tuttavia, non è un permeabilizzatore . È stato ideato un modello di legame della polimixina con il lipide A idrofobo altamente conservato di LPS , basato su studi NMR di polimixina in complesso con LPS. In questo modello, le ammine caricate positivamente interagiscono con i fosfati di LPS, mentre la coda lipofila e la regione dell’amminoacido lipofilo 6-7 del nucleo interagiscono con la coda lipidica dell’LPS. Alcuni derivati della polimixina senza significativa attività antibatterica hanno dimostrato di legarsi agli LPS e di permeabilizzare i batteri all’azione di altri antibiotici .
Le relazioni struttura–attività delle polimixine sono state ampiamente riviste nel 2010 e da quella data ci sono stati ulteriori sviluppi nella chimica medicinale e nelle indagini pre-cliniche dirette sia a ridurre la tossicità che ad aumentare il livello di attività, in particolare nei confronti di ceppi emergenti multiresistenti.
Polymyxins exhibit nephrotoxicity at levels close to the therapeutic dose, as well as a number of poorly characterised acute toxicological effects. Il meccanismo di nefrotossicità è attualmente in fase di studio , tuttavia, si ritiene che sia correlato alla natura cationica della molecola e all’accumulo all’interno delle cellule epiteliali tubulari prossimali renali, con assorbimento mediato dal recettore multi-ligando, megalin . La citotossicità è stata determinata nei tipi di cellule in cui il farmaco si accumula, ad esempio cellule tubolari prossimali renali umane (HK-2) o cellule epiteliali tubulari prossimali (PTEC) e può comportare danni mitocondriali o il coinvolgimento di specie reattive dell’ossigeno.
Negli ultimi anni sono stati intrapresi numerosi approcci per ridurre la tossicità e migliorare l’indice terapeutico delle polimixine. La sintesi totale di nuovi derivati della polimixina, attraverso la sintesi peptidica in fase solida, è stata la via principale, consentendo la manipolazione in qualsiasi punto della struttura della polimixina. Anche la semi-sintesi a partire dalla polimixina stessa è stata ampiamente utilizzata, attingendo alla capacità di vari enzimi di fendere selettivamente la coda lipofila e la catena tripeptidica in posizioni specifiche. È stata anche ottenuta una protezione selettiva dei gruppi amminici terminali dei residui Dab, consentendo la semi-sintesi di una varietà di derivati del nonapeptide.
È stato riportato che la rimozione della coda lipofila e dell’amminoacido 1 per lasciare la polimixina B nonapeptide (PMBN) (52) porta ad una significativa riduzione della nefrotossicità e dell’attività antibatterica pur mantenendo la capacità della molecola di permeabilizzare i batteri all’azione di altri antibiotici. Questa riduzione della tossicità è stata recentemente confermata da studi in vivo presso AstraZeneca, in cui l’istopatologia ha rivelato notevoli cambiamenti nei reni dei ratti trattati con colistina rispetto a quelli trattati con PMBN o controllo del veicolo.
In una serie di derivati privi della catena grasso-acile, Katsuma e colleghi hanno studiato analoghi della polimixina Pseudomonas-specifici . La sostituzione della catena grasso-acilica e dell’amminoacido 1 della polimixina con tutti i residui basici, come la catena Dab-Dab-Dab (53a), ha determinato un’attività Pseudomonas potente e selettiva in vitro, ma con un aumento della tossicità acuta nel topo. Un piccolo amminoacido idrofilo all’N-terminale (acido propionico di-amminico (Dap) o serina) (53b,c) ha provocato l’attività di Pseudomonas in vitro paragonabile alla polimixina B stessa. L’analogo Dap (53b) ha mostrato una tossicità acuta 4,9 volte inferiore rispetto alla polimixina B nel topo. L’effetto sulla tossicità renale non è stato riportato in questa serie.
Un approccio adottato dagli antibiotici del Nord per ridurre la tossicità dei derivati della polimixina è stato quello di ridurre il numero di cariche positive nella molecola. Sebbene i residui Dab nella porzione ciclica della polimixina si siano dimostrati cruciali sia per il legame con LPS che per la successiva attività antibatterica , il legame con LPS può ancora avvenire in analoghi privi di residui amminici nella porzione lineare del peptide . Tali derivati possono agire come permeabilizzatori di altri antibiotici e alcuni hanno attività di per sé contro uno spettro più ristretto di organismi. Esempi includono i nonapeptidi NAB-7061 (54a) con aminobutirrato in posizione 3 e NAB-739 (54b) con d-serina in posizione 3. Entrambi mantengono la capacità della polimixina di permeabilizzare la membrana esterna e agiscono sinergicamente con altri antibiotici. Sia NAB-7061 che NAB-739 hanno dimostrato affinità inferiori (ca. un quinto più basso) per la membrana del bordo del pennello della corteccia renale rispetto alla polimixina, come dimostrato in un test di spostamento della gentamicina radiomarcato. NAB-739 ha dimostrato una citotossicità inferiore in una linea cellulare HK-2 con valori IC50 circa 26 volte inferiori rispetto alla polimixina B. NAB-739 ha anche dimostrato attività antibatterica sia in vitro che in vivo. Mentre la profilatura in vitro ha mostrato una buona attività contro E. coli e Klebsiella, l’attività è stata ridotta rispetto alla polimixina contro le specie Pseudomonas. NAB-739 ha dimostrato l’efficacia in un modello di infezione da E. coli , tuttavia, ad oggi non sono stati riportati studi di tossicità in vivo.
Cubist Pharmaceuticals ha riferito sulla riduzione della tossicità mediante la sostituzione della coda lipofila della polimixina con un’aril urea nel composto CB-182,804 (55). Finora questo è l’unico della nuova generazione di polimixine a passare agli studi di fase I, dopo aver dimostrato una ridotta nefrotossicità nelle scimmie cynomolgous .
Pfizer ha recentemente riportato la sintesi di una varietà di derivati della polimixina in cui il Dab-3 della porzione lineare della catena aminoacidica è stato sostituito con acido di-amminico propionico Dap , che è stato segnalato per migliorare l’attività antibatterica. Una varietà di gruppi terminali biaril sono stati studiati con la conclusione che i composti con catene laterali più polari, come misurato da ClogD erano meno citotossici contro la linea cellulare renale hRPTEC, ma avevano una tendenza generale a ridurre la potenza antibatterica. Tuttavia, un particolare composto Pfizer, 5x (56) in cui la coda lipofila della polimixina è stata sostituita da una porzione polare di N-fenil piridone, ha mostrato una tossicità in vitro notevolmente ridotta rispetto alla polimixina pur mantenendo l’attività. Il composto 5x è stato esaminato in vivo per il potenziale nefrotossico rispetto alla polimixina B nel ratto in uno studio di 7 giorni. A un livello di esposizione in cui la polimixina B ha prodotto lesioni renali necrotiche in ogni animale (anche se minime) (56) non ha mostrato incidenza di lesioni renali necrotiche. Tuttavia, nel cane, non è stato segnalato alcun margine di sicurezza significativo di (56) rispetto alla polimixina B. Comprendere la relazione tra tossicità in vitro e situazione in vivo nelle polimixine è ancora un ostacolo da superare.
Cantab anti-infectives ha riferito che i derivati nonapeptidici della polimixina in cui la catena acilica contiene una funzionalità polare dimostrano una ridotta tossicità in vitro e in vivo pur mantenendo l’efficacia in vivo . Ad esempio, il composto (57) è stato confrontato con la polimixina B in un modello di infezione della coscia di topo di E. coli. Una dose totale di 10 mg / kg (i.v., b.i.d.) di (57) ha dato una riduzione del carico batterico di 4 log10 rispetto al controllo non trattato, mentre la stessa dose di polimixina ha ridotto il carico batterico di 4,8 log10. Risultati simili sono stati ottenuti in un modello di infezione di Klebsiella pneumoniae, dove (57) ha dato una riduzione simile della carica batterica (riduzione di 2,3 log10) alla colistina a 10 mg/kg. In vitro, (57) è risultato sei volte meno citotossico della polimixina misurata con IC50 rispetto alla linea cellulare HK-2. In vivo, in un modello di ratto di nefrotossicità, (57) ha dato livelli significativamente più bassi di biomarcatori urinari di danno renale (N-acetil-beta-d-glucosaminidasi, albumina e cistatina C) rispetto alla colistina allo stesso livello di dose.
Un altro approccio è stato preso dal gruppo della Monash University, che ha studiato le modifiche che mostrano attività contro ceppi resistenti . Polimixina con maggiore lipofilia in aminoacidi 6 e 7 del core, e una catena lipofila, ad esempio, FADDI-02 (58a) e FADD1-03 (58b) mostra una migliore attività contro ceppi resistenti di Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanii rispetto alla polimixina B. di tossicità In vitro non è segnalata, tuttavia, i composti sono stati valutati in un modello in vivo di nefrotossicità. L’esame istologico non ha mostrato lesioni in questi ratti trattati con FADDI-03 rispetto a segni positivi di danno renale negli animali trattati con polimixina B. Questa minore tossicità è stata attribuita all’elevato legame sierico della molecola, che impedisce l’accumulo nei reni.