Rotazione guidata dall’idrolisi di ATP

Il ciclo rotativo idrolitico è composto da tre fasi di 120o nel dominio catalitico F1 dell’enzima, definito negli esperimenti di rotazione biofisica da “dwells catalitici” . Ogni punto 120o è diviso nei sotto-punti definiti da una sosta catalitica dopo ogni punto 120o, con un “legame di ATP” d’intervento che abita a 30o ed un “rilascio del fosfato” abita a 95o. Il rilascio di fosfato permette che l’enzima completi il punto 120o ed arrivi all’abitazione obbligatoria di ATP. Abbiamo descritto le strutture del dominio F1-catalitico al rilascio di fosfato e alle dimore catalitiche e abbiamo dimostrato che il sub-step rotante 35o tra il rilascio di fosfato e le dimore catalitiche dipende dal rilascio di fosfato dal “legame ATP”, che quindi consente all’enzima di procedere al “dwell catalitico” . L’abitazione catalitica stessa rappresenta una transizione in cui una molecola di ATP legata diventa pronta per l’idrolisi. I nostri attuali sforzi sono incentrati sulla definizione dell’abitazione catalitica nell’encefalopatia F1-ATPasi.

Film Generazione di 30 ° di rotazione della γ-subunità encefalopatia F1-Atpasi, il rilascio di fosfato dal ßE-subunità. Il film inizia con una vista dal lato di F1-ThioP nella rappresentazione del nastro, con il tiofosfato legato come sfere arancioni. Le subunità α e β sono rispettivamente rosse e gialle. Quindi, le subunità aTP -, aDP -, ßTP – e ßDP-vengono rimosse in sequenza lasciando il dimero aEßE e le subunità del gambo centrale γ, δ e ε (blu, magenta e verde, rispettivamente). Questo sottocomplesso residuo viene ruotato a destra attorno all’asse y di 100° per esporre una vista laterale della subunità aE e del gambo centrale. Quindi, le subunità δ e ε e i residui γ – 42-210 vengono rimossi e la subunità ßE diventa più debole. Nei frame finali, il fosfato legato viene rilasciato e la subunità aE si apre e si allontana dalla subunità γ, interrompendo le interazioni di imballaggio tra le subunità AE e γ. Per ristabilire queste interazioni, la subunità γ ruota di 30°. La struttura dello stato finale è lo stato di rilascio post-fosfato della F1-ATPasi bovina trovata in F1-I3-ThioP.

Rotazione guidata da pmf

Il dato chiave mancante per comprendere la generazione di rotazione dal pmf è la struttura dettagliata a livello atomico del percorso che i protoni prendono attraverso il dominio di membrana dell’enzima. La migliore struttura disponibile fino ad oggi è quella che abbiamo determinato alla risoluzione di 4 Å nel 2015 mediante cristallografia a raggi X del complesso enzimatico di Paracoccus denitrificans . Altri sono stati determinati nel 2015 e nel 2016 mediante microscopia crio-elettronica di singole particelle degli enzimi bovini e fungini, nella migliore delle ipotesi a risoluzione 6 Å . Tuttavia, questi modelli mancano tutti i dettagli necessari per la formulazione di un meccanismo molecolare della generazione di rotazione dalla forza motrice del protone e, a causa della motilità e della flessibilità degli enzimi, le singole particelle dell’enzima possono adottare molte posizioni diverse. Pertanto, presenta un problema insolitamente difficile per l’approccio crio-em.

Figura il dominio di membrana della F-ATPasi da P. angusta. In A-D, la subunità a è blu fiore di mais. A e B, viste in rappresentazione solida dal lato e sotto il dominio della membrana. L’anello c10 è grigio, la subunità b (parte superiore non mostrata) è rosa, e i segmenti giallo pallido, rosso mattone, ciano chiaro e beige sono α-eliche transmembrana, Ch1-Ch4 assegnati alla subunità f, ATP8, aH1 e bH1, rispettivamente. Nell’anello c, I-IV indicano le quattro α-eliche transmembrana C-terminale a contatto con la subunità a. C e D, viste della subunità a in rappresentazione solida e cartoon viste dall’esterno e guardando dall’interfaccia con l’anello c, rispettivamente, con aH1 in ciano pallido. I residui polari conservati sono gialli, le posizioni delle mutazioni umane associate a patologie (vedi Tabella S1) sono rosse. La sfera rosa denota l’Arg-179 conservato in aH5 che è essenziale per la traslocazione dei protoni. La freccia inferiore indica il percorso di ingresso per i protoni che si trasferiscono a Glu-59 nell’α-elica-II del C-terminale dell’anello C. Vengono trasportati attorno all’anello ruotando in senso antiorario come visto dall’alto, fino ad arrivare ad Arg-179 dove entrano nel percorso di uscita, indicato dalla freccia superiore.

Strutture di ATP sintasi batteriche

Figura ATP sintasi batteriche. (A) F1-ATPasi da Caldalkalibacillus thermarum a risoluzione di 2,6 Å mediante cristallografia a raggi X; (B) enzima ATP sintasi da Paracoccus denitrificans a risoluzione di 4 Å mediante cristallografia a raggi X; (C) ATP sintasi da Escherichia coli a risoluzione di 7 Å mediante crio-EM.

Rispetto agli studi approfonditi che abbiamo condotto sugli enzimi mitocondriali, le strutture delle ATP sintasi batteriche sono state poco studiate, ad eccezione delle strutture dei domini catalitici F1 degli enzimi di Escherichia coli e Geobacillus stearothermophilus (precedentemente Bacillus stearothermophilus) a risoluzione 3.2 e 3.9 Å, rispettivamente, e delle strutture degli anelli c dai loro domini di membrana di varie specie . Per colmare questa lacuna, finora abbiamo contribuito con la struttura dell’intero enzima da Paracoccus denitrificans a 4 Å di risoluzione , e, in collaborazione con il Professor G. M. Cook e colleghi di Dunedin, in Nuova Zelanda, le strutture della F1 domini catalitici di ATP sintasi da Caldalkalibacillus thermarum, Fusobacterium nucleatum e Mycobacterium smegmatis. C. thermarum è un thermoalkaliphile e la struttura del suo dominio catalitico alla risoluzione di 2,6 Å è la struttura più accurata di una F1-ATPasi batterica ancora determinata . L’enzima da M. smegmatis è strettamente correlato all’enzima di M. tuberculosis. La struttura del suo dominio catalitico è stata determinata a una risoluzione di 4 Å e fornisce un obiettivo per lo sviluppo di nuovi farmaci anti-tubercolari . Il patogeno parodontale opportunistico, Fusobacterium nucleatum, è associato a una vasta gamma di malattie tra cui infezioni orali, esiti di gravidanza avanzati, malattie gastrointestinali e aterosclerosi. Inoltre, è stato collegato allo sviluppo e alla progressione del cancro del colon-retto attraverso l’inibizione delle vie di segnalazione immunitaria antitumorale e la successiva promozione della chemioresistenza. È un anaerobo obbligato e accoppia l’energia libera della decarbossilazione del glutaconil-CoA al crotonil-CoA al trasporto di ioni Na+ attraverso la sua membrana cellulare per generare una forza motrice di ioni sodio (smf). L’ATP sintasi utilizza l’smf per guidare la sintesi di ATP necessaria per le reazioni cataboliche e anaboliche. La struttura del suo dominio catalitico F1 è stata determinata con una risoluzione di 3,6 Å . Utilizzando crio-EM , è stata pubblicata una mappa dell’ATP sintasi intatta di E. coli che mostra la subunità ε nella posizione “up” (vedi sotto), e recentemente, una struttura dell’ATP sintasi da Geobacillus stearothermophilus è stata determinata a 3 Å .

Struttura del parassita ATP sintasi

Figura la F1-ATPasi da Trypanosoma brucei. Le subunità α-, β-, γ-, δ-, ε-e p18 sono rispettivamente rosse, gialle, blu, verdi, magenta e ciano. (A e B) Rappresentazioni di cartoni animati delle viste laterali e superiori; (C-E) rappresentazioni superficiali di (C), la F1-ATPasi bovina, (D), la T. enzima brucei in grigio con p18 rimosso e le sezioni colorate che mostrano gli amminoacidi aggiuntivi all’enzima bovino, e (E), l’enzima T. brucei con p18 presente.

Le strutture e le funzioni dei componenti delle ATP sintasi, in particolare quelle subunità coinvolte direttamente nella formazione catalitica di ATP, sono ampiamente conservate in metazoani, funghi, eubatteri e cloroplasti vegetali. Sulla base di una mappa a 32.5 Å di risoluzione determinato in situ nei mitocondri delle euglenozoan parassita Trypanosoma brucei, dall’elettrone cryo-tomografia, è stato proposto che l’ATP sintasi in questa specie ha un non-canonica struttura con diversi siti catalitici, dove cataliticamente essenziale arginina-dito è fornito, non da subunità α adiacente al catalitica sito di legame del nucleotide, come in tutte le specie studiate per data, ma da una proteina chiamata p18 trovato solo in euglenozoa . In collaborazione con la Drs Alena Zíková e Ondřej Gahura dell’Istituto di Parassitologia di České Budějovice nella Repubblica Ceca, abbiamo caratterizzato la F1-ATPasi da T. brucei e determinato una struttura cristallina dell’enzima a risoluzione 3.2 Å . Questa struttura mostra che la proposta secondo cui il dominio catalitico di questa ATP sintasi ha una struttura non canonica e diversi siti catalitici non è corretta. Per molti aspetti, la struttura della T. brucei F1-ATPasi è strettamente simile a quella delle F1-ATPasi determinate in precedenza. La porzione α3β3-sferica del dominio catalitico, dove si trovano i tre siti catalitici, più il gambo centrale, sono altamente conservati, e il dito arginina è fornito convenzionalmente dalle α-subunità adiacenti a ciascuno dei tre siti catalitici trovati nelle β-subunità. Pertanto, l’enzima ha un meccanismo catalitico convenzionale. La struttura differisce da quelle precedenti avendo una subunità p18, identificata solo negli euglenozoi, associata alla superficie esterna di ciascuna delle tre subunità α, elaborando così il dominio F1. La subunità p18 è una proteina pentatricopeptide repeat (PPR) con tre PPRs e sembra non avere alcuna funzione nel meccanismo catalitico dell’enzima. T. brucei è l’agente eziologico della malattia del sonno nell’uomo e delle malattie correlate negli animali domestici che vivono nell’Africa sub-sahariana e la struttura delle sue F1-ATPasi fornisce un obiettivo per lo sviluppo di nuovi farmaci per il trattamento della malattia.

Il ruolo della cardiolipina

La cardiolipina lipidica anionica è un componente essenziale delle ATP sintasi attive. Nei metazoani, i loro rotori contengono un anello di otto subunità c costituite da cerchi interni ed esterni di Α – eliche N-e C-terminali, rispettivamente. L’inizio dell’α-elica del C-terminale contiene un residuo rigorosamente conservato e completamente trimetilato della lisina nella regione del capo-gruppo del lipido della membrana. Anelli più grandi di struttura nota, da c9-c15 in eubatteri e cloroplasti, conservano una lisina o un residuo di arginina nella posizione equivalente. Nelle simulazioni al computer di membrane idrate contenenti anelli c8 bovini trimetilati o non metilati e anelli c10 o c11 batterici, i gruppi principali di molecole cardiolipin sono stati associati selettivamente con questi residui di lisina modificati e non modificati e con amminoacidi polari adiacenti e con una seconda lisina conservata sul lato opposto della membrana, mentre i lipidi fosfatidilici sono stati attratti poco da questi siti .

Figura modalità di legame della cardiolipina agli anelli c8 trimetilati. Le Α-eliche N-e C-terminali delle subunità c sono rispettivamente grigio scuro e grigio chiaro. Le molecole di cardiolipina sono verdi, con gruppi fosfatici rosa. Grandi sfere colorate rappresentano le perle a grana grossa per aminoacidi specifici, come indicato, che si trovano entro 0,7 nm delle perle di fosfato di cardiolipina. Parti A e B, la regione del gruppo dirigente della cardiolipina nel foglio interno della membrana legata, rispettivamente, a due subunità c adiacenti (subunità 8 e 1) e a una singola subunità c; parte C, una molecola di cardiolipina nel foglio esterno della membrana legata a una singola subunità C.

Tuttavia, i tempi di permanenza delle molecole di cardiolipina con l’anello erano brevi e sufficienti affinché il rotore girasse solo una frazione di grado nell’enzima attivo. Con l’anello c8 demetilato e con gli anelli c10 e c11, la densità delle molecole di cardiolipina legate in questo sito aumentava, ma i tempi di residenza non cambiavano notevolmente. Queste interazioni altamente specifiche ma brevi con l’anello c rotante sono coerenti con i ruoli funzionali della cardiolipina nella stabilizzazione e lubrificazione del rotore e, interagendo con l’enzima all’ingresso e all’uscita del canale protonico transmembrana, nella partecipazione alla traslocazione del protone attraverso il dominio della membrana dell’enzima.