ATP-hydrolyysillä ajettu kierto
hydrolyyttinen rotaatiosykli koostuu kolmesta 120o: n vaiheesta entsyymin katalyyttisessä F1-domeenissa, jotka on määritelty biofysikaalisissa rotaatiokokeissa ”katalyyttisillä asuinpaikoilla” . Jokainen 120o: n vaihe jaetaan alavaiheisiin, jotka määritellään kunkin 120o: n vaiheen jälkeen tapahtuvalla katalyyttisellä viipeellä, jonka välissä oleva ”ATP: n sitoutumisen” viipymä on 30o ja ”fosfaatin vapautumisen” viipymä on 95o. Fosfaatin vapautumisen ansiosta entsyymi voi suorittaa 120o-vaiheen ja saavuttaa ATP: n sitoutumisvaiheen. Olemme kuvanneet F1-katalyyttisen domeenin rakenteita fosfaatin vapautumisessa ja katalyyttisessä asumisessa, ja osoittaneet, että 35o: n pyörivä osavaihe fosfaatin vapautumisen ja katalyyttisen asumisen välillä riippuu fosfaatin vapautumisesta ”ATP: n sitoutumisesta”, mikä mahdollistaa sitten entsyymin etenemisen ”katalyyttiseen asumiseen” . Itse katalyyttinen viipymä edustaa siirtymää, jossa sitoutunut ATP-molekyyli ryhtyy hydrolyysiin. Nykyinen toimintamme keskittyy enkefalopatian F1-ATPaasin katalyyttisen viipymän määrittelyyn.
elokuvasukupolvi, jossa γ-alayksikkö kiertyy 30o enkefalopatian F1-atpaasissa vapauttamalla fosfaattia ße-alayksiköstä. Elokuva alkaa näkymällä F1-Tiopin sivusta nauhamaisesti, sidottuna tiofosfaattina oransseina palloina. Α-Ja β-alayksiköt ovat punaisia ja keltaisia. Tämän jälkeen ATP-, aDP -, ßTP-ja ßDP-alayksiköt poistetaan peräkkäin jättäen aEßE-dimeerin ja keskivarren alayksiköt γ, δ Ja ε (vastaavasti sininen, magenta ja vihreä). Tätä jäljelle jäävää subkompleksia käännetään 100° oikealle y-akselin ympäri, jotta ae-alayksikön ja keskivarren sivunäkymä paljastuisi. Tämän jälkeen δ – Ja ε-alayksiköt ja jäännökset γ-42-210 poistuvat ja ßE-alayksikkö muuttuu himmeämmäksi. Lopullisissa kehyksissä sitoutunut fosfaatti vapautuu ja ae-alayksikkö avautuu ja siirtyy pois γ – alayksiköstä, mikä häiritsee ae-ja γ-alayksiköiden välisiä pakkausvuorovaikutuksia. Näiden vuorovaikutusten palauttamiseksi γ-alayksikkö pyörii 30°. Lopputilan rakenne on F1-I3-Tiopissa esiintyvän naudan F1-ATPaasin fosfaatin vapautumisen jälkeinen tila.
PMF: n pyöriminen
keskeinen puuttuva datumi PMF: n pyörimisliikkeen syntymisen ymmärtämiseksi on sen reitin yksityiskohtainen rakenne atomitasolla, jonka protonit kulkevat entsyymin kalvodomeenin läpi. Tähän mennessä paras käytettävissä oleva rakenne on se, jonka määritimme 4 Å-resoluutiolla vuonna 2015 Paracoccus denitrificans-entsyymikompleksin Röntgenkristallografialla . Toiset määritettiin vuosina 2015 ja 2016 kryoelektronimikroskopialla naudan ja sienientsyymien yksittäisistä hiukkasista, parhaimmillaan 6 Å: n tarkkuudella . Näistä malleista puuttuu kuitenkin kaikki protoni-motivoimasta pyörimisliikkeen syntymisen molekyylimekanismin muotoiluun vaadittavat yksityiskohdat, ja entsyymien motiliteetin ja joustavuuden vuoksi entsyymin yksittäiset hiukkaset voivat omaksua monia erilaisia kantoja. Siksi se on harvinaisen vaikea ongelma Kryo-em-lähestymistavalle.
kuvaa F-ATPaasin kalvodomaani P. angustasta. A-D: ssä a-alayksikkö on maissinkukkasininen. A ja B, näkymät vankka esitys puolelta, ja alla kalvo domain. C10-rengas on harmaa, B-alayksikkö (yläosa ei näy) on vaaleanpunainen, ja vaaleankeltaiset, tiilenpunaiset, vaaleat syaani-ja beiget segmentit ovat transmembraanisia α-kierteitä, CH1-Ch4, jotka on liitetty alayksikköön f, ATP8, aH1 ja bH1. C-renkaassa I-IV osoittaa neljä transmembraanista C-terminaalista α-heliksiä, jotka ovat kosketuksissa alayksikköön a. C ja D, A-alayksikön näkymiä kiinteänä ja sarjakuvamaisena kuvauksena ulkopuolelta katsottuna ja c-renkaan rajapinnasta katsottuna, vastaavasti kalpeana syaanina ilmaistuna AH1: n kanssa. Säilyneet polaarijäämät ovat keltaisia, patologioihin liittyvien ihmisen mutaatioiden kannat (KS.taulukko S1) ovat punaisia. Vaaleanpunainen pallo merkitsee konservoitua Arg-179: ää AH5: ssä, joka on välttämätön protonin translokaatiolle. Alempi nuoli osoittaa sisääntuloreitin protoneille, jotka siirtyvät c-renkaan C-terminaalisessa α-helix-II: ssa Glu-59: ään. Niitä kuljetetaan renkaan ympäri vastapäivään pyörimällä ylhäältä katsottuna, kunnes ne saapuvat Arg-179: lle, jossa ne tulevat uloskäyntireitille, jota merkitään ylemmällä nuolella.
bakteerien ATP-syntaasien rakenteet
kuvaavat bakteerien ATP-syntaaseja. A) Caldalkalibacillus thermarumin F1-ATPaasi 2, 6 Å-resoluutiolla Röntgenkristallografialla; B) Paracoccus denitrificansin ATP-syntaasientsyymi 4 Å-resoluutiolla Röntgenkristallografialla; C) Escherichia coli-bakteerin ATP-syntaasi 7 Å-resoluutiolla Kryo-EM: llä.
verrattuna laajoihin tutkimuksiin, joita olemme tehneet mitokondrioentsyymeillä, bakteerien ATP-syntaasien rakenteita on tutkittu vain vähän, lukuun ottamatta Escherichia coli-ja Geobacillus stearothermophilus-entsyymien F1-katalyyttisten domeenien rakenteita 3.2 ja 3.9 Å-resoluutioilla, sekä C-renkaiden rakenteita niiden kalvodomeeneista eri lajeilta . Täyttääksemme tämän aukon olemme tähän mennessä edistäneet Paracoccus denitrificans-entsyymin rakennetta 4 Å-resoluutiolla ja yhteistyössä professori G. M. Cookin ja Dunedinissa , Uudessa-Seelannissa työskentelevien kollegoidemme kanssa caldalkalibacillus thermarumin, Fusobacterium nucleatumin ja Mycobacterium smegmatisin ATP-syntaasien F1-katalyyttisten domeenien rakenteita. C. thermarum on termoalkalifiili, ja sen katalyyttisen domeenin rakenne 2,6 Å-resoluutiolla on tarkin bakteerin F1-ATPaasin toistaiseksi määritetty rakenne . M: n entsyymi. smegmatis on läheistä sukua M. tuberculosis-bakteerin entsyymille. Sen katalyyttialueen rakenne on määritetty 4 Å: n tarkkuudella, ja se tarjoaa tavoitteen uusien tuberkuliinilääkkeiden kehittämiselle . Opportunistinen parodontiitti Fusobacterium nucleatum liittyy moniin sairauksiin, kuten suun infektioihin, raskauden etenemiseen, ruoansulatuskanavan sairauksiin ja ateroskleroosiin. Lisäksi se on yhdistetty kolorektaalisyövän kehittymiseen ja etenemiseen estämällä kasvaimen immuunisignaalireittejä ja edistämällä myöhemmin kemoresistenssiä. Se on anaerobinen ja sitoo glutakonyyli-CoA: n dekarboksylaation vapaan energian krotonyyli-CoA: han Na+ – ionien kuljetukseen solukalvonsa läpi natriumionimotiivisen voiman (smf) tuottamiseksi. ATP-syntaasi käyttää smf: ää ajaakseen katabolisissa ja anabolisissa reaktioissa tarvittavan ATP: n synteesiä. Sen F1-katalysaattorin rakenne on määritetty 3,6 Å: n tarkkuudella . Cryo-EM: n avulla on julkaistu E. colin ehjän ATP-syntaasin kartta, jossa ε-alayksikkö on ”up” – asennossa (katso alla) , ja äskettäin Geobacillus stearothermophilus-bakteerin ATP-syntaasin rakenne on määritetty 3 Å: ksi .
loisten ATP-syntaasien rakenne
kuvaa Trypanosoma brucei-bakteerin F1-Atpaasia. Α-, β-, γ-, δ-, ε-ja P18-alayksiköt ovat punainen, keltainen, sininen, vihreä, magenta ja syaani. (A ja B) pilapiirrokset sivu-ja ylänäkymistä; (C-E) pintaesitykset C), naudan F1-ATPaasi, (D), T. brucei-entsyymi harmaana, p18 poistettu ja värilliset kohdat, joissa näkyvät naudan entsyymin lisäksi aminohapot, sekä E) T. brucei-entsyymi, jossa on P18.
ATP-syntaasien komponenttien rakenteet ja toiminnot, erityisesti ne alayksiköt, jotka osallistuvat suoraan ATP: n katalyyttiseen muodostumiseen, säilyvät laajalti metatsoaaneissa, sienissä, eubakteereissa ja kasvien kloroplasteissa. Kartan perusteella 32.5 Å resoluutio euglenotsoalaisen loisen, Trypanosoma brucei, mitokondrioissa paikan päällä elektronikryotomografian avulla on ehdotettu, että tämän lajin ATP-syntaasilla on ei-kanoninen rakenne, jossa on erilaisia katalyyttisiä kohtia, joissa katalyyttisesti välttämätön arginiinisormi ei ole katalyyttisen nukleotidin sitoutumiskohdan vieressä oleva α-alayksikkö, kuten kaikilla tähän mennessä tutkituilla lajeilla, vaan proteiini nimeltä P18, jota esiintyy ainoastaan euglenoeläimessä . Yhteistyössä České Budějovicen parasitologian instituutin Drs Alena Zíkován ja Ondřej Gahuran kanssa olemme luonnehtineet T. brucein F1-ATPaasin ja määrittäneet entsyymin kiderakenteen 3,2 Å: n resoluutiolla . Tämä rakenne osoittaa, että ehdotus siitä, että tämän ATP-syntaasin katalyyttisellä domeenilla olisi ei-kanoninen rakenne ja erilaiset katalyyttiset paikat, on virheellinen. T. brucei F1-ATPaasin rakenne on monilta osin hyvin samankaltainen kuin aiemmin määritetyillä F1-Atpaaseilla. Katalyyttisen domeenin α3β3-pallomainen osa, jossa on kolme katalyyttistä kohtaa sekä keskimmäinen varsi, on hyvin säilynyttä, ja arginiinisormen tarjoaa tavanomaisesti α-alayksiköt, jotka sijaitsevat kunkin β-alayksikön kolmen katalyyttisen paikan vieressä. Entsyymillä on siis tavanomainen katalyyttinen mekanismi. Rakenne eroaa aiemmista siten, että siinä on vain euglenozoolla tunnistettu P18-alayksikkö, joka liittyy kunkin kolmen α-alayksikön ulkopintaan, jolloin muodostuu F1-alayksikkö. Alayksikkö p18 on pentatricopeptide repeat (PPR) – proteiini, jolla on kolme PPRs: ää, eikä sillä näytä olevan mitään tehtävää entsyymin katalyyttisessä mekanismissa. T. brucei on Saharan eteläpuolisessa Afrikassa elävien kotieläinten unitaudin ja siihen liittyvien sairauksien aiheuttaja, ja sen F1-Atpaasien rakenne tarjoaa tavoitteen kehittää uusia lääkkeitä taudin hoitoon.
kardiolipiinin rooli
anioninen lipidikardiolipiini on aktiivisten ATP-syntaasien olennainen osa. Metatsoaaneilla niiden roottoreissa on kahdeksan C-alayksikön rengas, joka koostuu n – ja C-terminaalisten α-kierteiden sisä-ja ulkokehistä. C-terminaalisen α-helixin alku sisältää tiukasti säilyneen ja täysin trimetyloidun lysiinijäämän kalvon lipidipääryhmän alueella. Eubakteerien ja kloroplastien C9-c15: stä tunnetut suuremmat renkaat säilyttävät joko lysiinin tai arginiinijäämän vastaavassa asennossa. Tietokonesimulaatioissa hydratoiduista kalvoista, jotka sisälsivät trimetyloituja tai metyloimattomia naudan C8-renkaita ja bakteerien C10 – tai C11-renkaita, kardiolipiinimolekyylien pääryhmät yhdistyivät selektiivisesti näihin modifioituihin ja muokkaamattomiin lysiinijäämiin ja viereisiin polaarisiin aminohappoihin sekä toiseen säilyneeseen lysiiniin kalvon vastakkaisella puolella, kun taas fosfatidyylilipidejä ei juurikaan houkuteltu näihin kohtiin .
kuva kardiolipiinin sitoutumisesta trimetyloituihin c8-renkaisiin. C-alayksiköiden n-ja C-terminaaliset α-helikset ovat vastaavasti tummia ja vaaleanharmaita. Kardiolipiinimolekyylit ovat vihreitä, ja niissä on vaaleanpunaisia fosfaattiryhmiä. Suuret värilliset pallot edustavat tiettyjen aminohappojen karkeajyvähelmiä, jotka sijaitsevat 0,7 nm: n sisällä kardiolipiinin fosfaattihelmistä. A-ja B-osat, kardiolipiinin pääryhmäalue kalvon sisemmässä selosteessa, joka on sitoutunut vastaavasti kahteen vierekkäiseen c-alayksikköön (alayksiköt 8 ja 1) ja yhteen C-alayksikköön; C-osa, kardiolipiinimolekyyli kalvon ulommassa esitteessä, joka on sitoutunut yhteen c-alayksikköön.
kardiolipiinimolekyylien viipymisajat renkaan kanssa olivat kuitenkin lyhyet ja riittävät siihen, että roottori pyöri vain asteen murto-osan aktiivisessa entsyymissä. Demetyloidulla c8 – renkaalla ja c10-ja c11-renkailla sidottujen kardiolipiinimolekyylien tiheys tällä paikalla kasvoi, mutta viipymisajat eivät muuttuneet suuresti. Nämä erittäin spesifiset mutta lyhyet vuorovaikutukset pyörivän c-renkaan kanssa ovat yhdenmukaisia kardiolipiinin funktionaalisten roolien kanssa roottorin stabiloinnissa ja voitelussa sekä vuorovaikutuksessa entsyymin kanssa transmembraanin protonikanavan sisääntulossa ja ulostulossa osallistumisessa protonin translokaatioon entsyymin kalvoalueen läpi.
elokuvasimulaatio kardiolipiinin vuorovaikutuksesta nauta C8-renkaan kanssa. Proteiinin selkäranka näkyy vaaleanharmaana, ja sivuketjut Lys-43 (punainen), Gln-44 (keltainen), Gln-45 (sininen) ja ser-48 (Syaani) näkyvät palloina. Kardiolipiinimolekyylit esitetään vihreinä tikkuina, fosfaatit vaaleanpunaisina palloina; POPC-ja POPE-molekyylit tummanharmaina tikkuina fosfaattien ollessa tummanharmaita palloja.