geeni-ekspressioon perustuva rasvakudosnäytteiden dekonvoluutio käyttäen at21 signature matrix

at21 signature matrix kehitettiin tarkoituksena määrittää rasvakudosnäytteiden solukoostumus. Se koostuu solutyyppikohtaisista ekspressioprofiileista, joissa on 1872 mikroarray-luotainta 21 solutyypistä. 1872-koettimet valittiin optimoimaan allekirjoitusmatriisin kyky erottaa eri solutyypit, mikä näkyy minimoimalla solutyyppien välinen informaatio (toteutettu minimoimalla ehtoluku, KS. täydentävät menetelmät).

viikuna. 2A näytämme korrelaatiot allekirjoitusten välillä eri solutyypit, paljastaen korkea korrelaatiot liittyvät solutyypit, kuten ihonalainen ja perikardiaalinen adiposyyttien, tai mesenkymaalinen varsi/stroomasolut, kondrosyytit, osteoblastit, ja rasva varsi/stroomasolut (ASCs). Näiden joidenkin solutyyppien välisten korkeiden korrelaatioiden valossa lähdimme tutkimaan lähestymistapamme kykyä erottaa samankaltaiset solutyypit seuraavien kahden strategian avulla. Ensinnäkin, sovellamme dekonvoluutiota lähestymistapaa viiteaineistoon itseensä, mikä johtaa selkeään eroon solutyypeistä (Fig. 3A) positiivisena kontrollina sen osoittamiseksi, että ehdotetulla menetelmällä voidaan selvästi tunnistaa puhtaat solujäljet viiteaineistosta. Näytämme myös samassa kuvassa (kuva. 3B, C) tavanomaisten markkereiden ja Solumuotoisten ennustettujen ensisijaisten markkereiden normalisoitu ilmentymä vertailua varten viitetietokannan solutyypeistä. Kuvassa esitetään vertailu solutyyppikohtaisten tavanomaisten merkkiaineiden normalisoituneena ilmentymänä verrattuna CellMaDe-ennustettuihin markkereihin kullekin solutyypille. Toiseksi teemme dekonvoluutioanalyysin 779 rasvakudosnäytteen (lisätietoa S2) joukolla neljästä eri rasvakudosvarastosta (SAT, kaura, PAT ja EAT) ja tarkistamme, kuinka hyvin tulokset ovat sopusoinnussa kirjallisuusaineiston kanssa. Tämä toinen analyysi osoittaa, että rasvakudosnäytteissä ennustetaan olevan keskimäärin 14,5% ASCs, kun taas kolmen toisiinsa liittyvän solutyypin (mesenkymaaliset varsi – /stroomasolut, osteoblastit ja kondrosyytit) summa on keskimäärin alle 1%, mikä paljastaa kykymme erottaa nämä solutyypit oikein (täydentävä viikuna. S4). Lisäksi 95% SAT-näytteistä on perikardiaalisia adiposyyttejä 0% ja ihonalaisia adiposyyttejä keskimäärin 74%, kun taas kaura -, EAT-ja PAT-näytteissä on useimmiten ennustettu olevan enemmän perikardiaalisia adiposyyttejä kuin ihonalaisia adiposyyttejä, joskin ero on epäselvempi. Tämä paljastaa ihonalaisten adiposyyttien ja adiposyyttien välisen selvän eron muista sisäelinten läheisyydessä olevista rasvavarastoista, mikä voidaan havaita ehdotetulla menetelmällä.

Tissuedekooderin solutyypin spesifisyys: Heatmaps of AT21 signature-matriisi, joka osoittaa a) solutyypin koostumuksen ennustamisen CIBERSORTISTA at21: n kanssa allekirjoitusmatriisi, (b) kirjallisuudesta valittujen tavanomaisten markkereiden normalisoitu lauseke ja (C) solumuotoisten ennustettujen ensisijaisten markkereiden normalisoitu lauseke. Kuvan yläpuolella oleva yhteinen xaxis tarkoittaa at21-allekirjoitusmatriisin solutyyppien merkitsemiseen käytettyjä näytteitä. CellMaDe ja CIBERSORT ovat molemmat koulutettuja AT21-signatuurimatriisilla, joten (A,C) ovat optimaalisia tuloksia molemmille tekniikoille, kun taas (B) edustaa perinteisten merkkiaineiden erotustehoa AT21-signatuurimatriisissa. Vihreät laatikot osoittavat kullekin solutyypille (sarakkeet) rivin sitä vastaavalla merkillä.

näiden arviointien jälkeen käytimme riippumatonta cross-platform (different Affymetrix microarray platforms)-validointitietokantaa testataksemme CIBERSORT-pohjaista dekonvoluutiota at21-allekirjoitusmatriisilla, mikä osoittaa, että lähestymistapamme antaa oikein korkeimmat prosenttiosuudet kunkin eristetyn solutyypin osalta kaikista testatuista solutyypeistä validointitietokannassa (täydentävä Kuva). S1C).

eristetyn solutyypin arvioitu keskimääräinen prosentuaalinen osuus on 69, 2% ihonalaisilla adiposyyteillä, 57, 1% ihonalaisilla Adiposyyteillä, 89, 9% B-soluilla, 84.8% CD4+ T-soluissa, 71, 0% CD8 + T-soluissa, 62, 0% NK-soluissa ja 90, 5% monosyyteissä. CD14+ – osan rasvakudoksesta (monosyytit/makrofagit) ennustetaan koostuvan pääasiassa makrofageista (25, 4%), myeloidisista dendriittisoluista (24, 4%) ja monosyyteistä (18, 1%). Poikkeama optimaalisista tuloksista perustuu itse vertailutietoihin (Kuva. 3a) voidaan selittää validointi-ja referenssitietojen eri alustojen välisillä eroilla (validointitietokanta ja referenssitietokanta on hybridisoitu kahdeksi eri Affymetrix-mikroryhmäksi).

Solumaiset primaariset ja sekundaariset markkerit

seuraavaksi luonnehdimme signaturismatriisia selvittämällä, mitkä geenit siihen sisältyvät, ja vertaamalla niiden solutyyppispesifisyyttä tavanomaisesti käytettyjen solutyyppisten markkereiden spesifisyyteen käyttäen primaarisia ja sekundaarisia merkkiaineita (Eqs). 1 ja 2 menetelmäosiossa). Tämä on johtanut ranking kaikkien luotaimet läsnä array mukaan niiden ensisijainen ja toissijainen kriteeri pisteet. Kuvassa. 2b, näytämme 10 parasta geeniä, joilla on korkein ensisijainen ja toissijainen kriteeri neljästä solutyypistä – eli ASCs: stä, CD8+ T – soluista, makrofageista ja ihonalaisista adiposyyteistä-ja osoitamme niiden solukohtaisen sijainnin geenitermien mukaisesti (Kaikkien 21 solutyypin osalta ks.täydentävä Kuva. S2, Lisätiedot S3). Kaikki at21-allekirjoitusmatriisissa esiintyvät geenit on merkitty lihavoidulla merkillä, mikä osoittaa, että cibersortin algoritmi valitsee pääasiassa toissijaisten merkkiaineiden yhdistelmän (CIBERSORTIN geenivalintakriteeri on verrattavissa toissijaisten merkkiaineiden kriteereihin), kun taas ensisijaiset markkerit ja tavanomaiset merkit eivät aina sisälly allekirjoitusmatriisiin.

Tämä on vastakohta klassisille merkkiainepohjaisille lähestymistavoille, kuten immunohistokemialle, jotka nojaavat voimakkaasti yksittäisen (primaarisen) merkkiaineen solutyyppispesifisyyteen. Kuitenkin tavanomaisia merkkiaineita, kuten makrofagien CD68, ilmaistaan myös muissa solutyypeissä, kuten monosyyteissä, plasmasytoidisissa dendriittisoluissa10, ja vähäisemmässä määrin myös fibroblasteissa ja endoteelisoluissa11,12, mikä ilmenee myös sen suhteellisen alhaisena primaarisena kriteerinä (Fig. 2b). Siksi ehdotamme, että cellmaden tunnistamat ensisijaiset markkerit vahvistettaisiin edelleen kokeellisesti ennen kuin ne selvitettäisiin vaihtoehtoisina markkereina rasvakudoksen solutyypeille.

CD8+ T-soluissa perinteisesti käytetty merkkiaine (differentiaatioryhmä 8B; CD8B) on tunnistettu vahvimmaksi primaarimarkkeriksi, mikä ei ollut kovin yllättävää. Differentiaatioryhmä 4 (CD4) ei kuitenkaan ole kovin spesifinen CD4+ T-soluille, mikä näkyy sen vallitsevana ilmentymänä muissa hematopoieettisissa solutyypeissä, kuten monosyyteissä tai makrofageissa (Kuva. 3B, täydentävä Kuva. S2). Tämä on myös syy siihen, että virtaussytometriassa CD4: ää käytetään vasta CD3+ – solupopulaation (T-solujen) tunnistamisen jälkeen CD4+ T-solujen tunnistamiseen. Dendrosyytin ilmentämä seitsemän Transmembraaniproteiinia (DCSTAMP) on analyysimme mukaan tunnistettu makrofagien hyvin spesifiseksi primaarimarkkeriksi. Kuvassa. 3C havaitsemme, että dcstampin korkea ilmentyminen rajoittuu makrofaginäytteiden osajoukkoon, mikä saattaa korostaa sen erityisyyttä makrofagien osajoukkoon, esim.makrofagijättiläisten kaltaisiin soluihin, kuten aiemmat tutkimukset13 ehdottavat. Acc-järjestelmien osalta tunnistettu ensisijainen merkki EEA1 ei ole kovin silmiinpistävä. Tälle solutyypille suosittelemme toissijaisten merkkiaineiden yhdistelmää, joka on toteutettu virtaussytometriastrategioissa sekä CIBERSORT-algoritmissa.

ihonalaisten adiposyyttien tapaus näyttää olevan samanlainen, sillä myöskään ensisijainen merkkiaine CMA1 ei ole kovin silmiinpistävä. Tämä voi kuitenkin johtua siitä, että perikardiaaliset adiposyytit ovat myös osa vertailumatriisia. Näin ollen ensisijainen kriteeri ei tässä tapauksessa keskity ainoastaan adiposyyttien erottamiseen muista solutyypeistä, vaan myös adiposyyttien erottamiseen kahdesta eri Depotista. Siksi teimme lisäanalyysin yhdistämällä referenssimatriisin kaikki adiposyytit yhteen määrittääksemme adiposyyttien primaarimerkit. Tässä analyysissä adiposyyttien kolme tärkeintä ensisijaista merkkiainetta olivat SPARCL1, ADIPOQ ja THRSP.

tunnistettujen ensisijaisten merkkiaineiden lisäarviointia varten vertasimme niiden ilmentymistä laajemmassa riippumattomassa aineistossa, joka koostui 394 anatomisesti merkitystä kudosekspressioprofiilista (Supplementary Fig. S3, Täydentävät Menetelmät). Kuusi 21: stä ensisijaisesta merkkiaineesta on täysin validoitu siten, että ne osoittavat suurimman ilmentymän ehdotetussa solutyypissä: KALSRL endoteelisoluille, SPTA1 punasoluille, CD8B CD8+ T-soluille, MS4A1 B-soluille, PRSS33 eosinofiileille ja dcstamp makrofageille. Kaksitoista merkkiainetta on osittain validoitu, ja niiden on todettu olevan viiden suurimman joukossa 394 anatomisesti merkityn kudoksen ilmentymisprofiilin joukossa tai ilmaistavan korkeammalla tasolla vain solutyypeissä, jotka eivät liity rasvakudokseen, kuten myosyytit tai hermosolut. Vain kolmea merkkiainetta Ei validoitu, eli Eea1: tä ASCs: lle, rgs5: tä sileälihassoluille ja pf4v1: tä verihiutaleille, koska pf4v1: n validointitiedoissa ei ollut verihiutaleita, mikä esti sen asianmukaisen arvioinnin.

lopuksi käytimme riippumatonta validointitietokantaa arvioidaksemme tunnistettujen ensisijaisten huippumerkkien syrjivää voimaa. Tämän analyysin tulokset on esitetty täydentävässä Kuvassa. S1 ja lisätiedot S2, jotka osoittavat, että ensisijaiset markkerit on ilmaistu ja että ne pystyvät erottamaan solutyypit validointitiedoissa, lukuun ottamatta CMA1: tä ihonalaisten adiposyyttien osalta ja EEA1: tä ASCs: n osalta (täydentävä Kuva). S1B).

Contextualization of findings – A literature review

arvioinnin seuraavana vaiheena olemme koonneet kvantitatiivisia kirjallisuusraportteja ihmisen rasvakudoksen solutyypin koostumuksesta verrataksemme dekonvoluutiomenetelmämme arvioita 1119 SAT-näytteestä (616 mikroarray ja 503 RNA-Seq-tietokokonaisuutta) ja 51 KAURANÄYTTEESTÄ kirjallisuudessa ilmoitettuihin prosenttilukuihin.

ensin etsimme kirjallisuudesta mahdollisia raportteja, jotka määrittäisivät rasvakudoksen adiposyyttien prosenttiosuuden. Tämä haku paljasti joukon arvioita ~93% 14: stä, ~70% 15,16: sta ja ~15% 17: stä, mikä voi mahdollisesti selittyä eroilla näytteiden käsittelyssä (esim.verisuonten poisto) ja laskentamenetelmissä (esim. histologia vs. solujen eristäminen, erilaiset merkkiaineet). Glastonbury ja kollegat arvioivat äskettäin adiposyyttien fraktion kahdessa populaatiotasoisessa ihonalaisen rasvakudoksen RNA-Seq-aineistossa (TwinsUK, n = 766 ja genotyyppi-kudoksen Ilmentymisprojekti , n = 326) arvioimalla neljän eri solutyypin (adiposyytit, makrofagit, CD4 + T-solut ja mikro-verisuonten endoteelisolut) suhteellisia osuuksia. Heidän arvionsa adiposyyttien mediaaniprosentille on 62% GTEx: llä ja 82% TwinsUK study18: lla.

myöhemmin keskityimme tutkimuksiin, joissa määritettiin muiden kuin adiposytoosien fraktioita19 ja sisällytimme 25 alkuperäistä tutkimusta tarkasteluumme. Näistä tutkimuksista saatujen solujakeiden kvantitatiiviset tulokset on esitetty kuvassa. 4 ja lisätiedot S4 (KS.menetelmiä koskevat lisätiedot). Makrofagien raportoidut solumäärät vaihtelevat suuresti joidenkin tutkimusten keskimääräisestä alle 1%: n kokonaissolumäärästä toisen tutkimuksen keskimääräiseen 27%: iin kokonaissolumäärästä. Nämä melko suuret erot tutkimusten välillä voivat johtua useista tekijöistä, kuten (i) analysoitujen näytteiden todellisista biologisista eroista, (ii) makrofagien paikallisesta rikastumisesta (esim. crown-like structures), joka vaikuttaa erityisesti tuloksiin, joilla on alhainen kokonaissolumäärä, kuten immunohistokemia, (iii) tekniset erot käytettyjen menetelmien ja merkkiaineiden välillä ja (iv) erot Näytteiden käsittely-ja analysointiprotokollissa (esim.fluoresenssi cutoffs, käytetyt vasta-aineet). On tärkeää huomata, että erityisesti jotkut immunohistokemialliset tutkimukset raportoivat erittäin suuria makrofagimääriä (Fig. 4 A). Lisäksi raportoiduissa yksiköissä voi olla joitakin eroja eri tutkimusten välillä, sillä kaksi tutkimusta, joissa makrofagiprosentit ovat korkeimmat (keskiarvot 27% ja 26% makrofageja), ovat ainoat, jotka raportoidaan kohdassa ”makrofagit tumakkeiden kokonaismäärää kohti”. Olemme osoittaneet aiemmin, että kudosviipaleista tehdyt immunohistokemialliset tutkimukset voivat olla puolueellisia, koska ne perustuvat poikkileikkauksista (ohuista kudosviipaleista)20 tehtyihin havaintoihin. Tästä syystä voidaan väittää, että erityisesti adiposyyttien osalta poikkileikkaus voi kattaa lipidipisaran osia, mutta ei tumaa, mikä johtaa systemaattisiin eroihin laskentamenetelmien välillä.

Review of Adipose Tissue Cellular Composition: Literature review of reported adipose tissue cellular composition in comparison to our results using cibersort (in green). Esitetään kokonaissolujen keskimääräinen (pisteet), pienin ja suurin (nuolet) prosenttiosuus (laskettuna täydentävissä menetelmissä esitettyjen oletusten ja kaavojen mukaisesti) viidelle eri solutyypille – makrofageille (a), ASCs: lle (B), CD4+ T-soluille (C), CD8+ T-soluille (D) ja endoteelisoluille (E). Väri määrittää solulaskennassa käytetyn menetelmän selityksen mukaisesti. Harmaat pisteet ja nuolet kohdassa (A) ovat tuloksiamme, joissa makrofagi-ja monosyyttipisteet on laskettu yhteen. Se näkyy vertailukohtana, sillä myös makrofagimerkit CD68, HAM56 ja CD14 värjäävät monosyyttejä. Harmaa piste B: ssä on adventiaalis-adipoosistroomasolujen (musta piste samalla rivillä) ja endoteelisolujen summa, jotka erotettiin vastaavassa tutkimuksessa, mutta jotka todennäköisesti molemmat sisältyvät at21-matriisimme rasvavarsi-stroomasolupisteeseen. Kunkin havaintoalan vasemmalla puolella on maininta tutkimuksista, joista tulokset on otettu (KS.lisätiedot S4), ja käytetyt merkkiaineet. Liitännäisjärjestelmien ja endoteelisolujen osalta käytettiin merkkiaineiden yhdistelmää (KS.lisätiedot S4). Tutkimuksen viitekirjeeseen liitetty tähti kertoo, että tutkimukseen osallistuneen keskimääräinen painoindeksi oli yli 35. Se sisältyy lukuun, koska on raportoitu, että makrofagitiheys on lisääntynyt vaikeaa lihavuutta sairastavilla.

arvioidaksemme tutkimukseen osallistuneiden biologisten erojen mahdollista vaikutusta, erityisesti heidän lihavuusasteensa osalta, merkitsimme kaikki tutkimukset, joihin osallistui ihmisiä, joiden keskimääräinen painoindeksi oli yli 35 (vaikea lihavuus) tähdellä (Kuva. 4 A). Lihavuuden tilan ja makrofagimäärien välistä suhdetta on tutkittu useissa artikkeleissa21 raportoidaan makrofagimäärien lisääntymisestä ja lihavuuden lisääntymisestä joissakin, mutta ei kaikissa tutkimuksissa21,22,23,24,25,26. Lihavuuden tila ei kuitenkaan voi selittää havaittua vaihtelua ilmoitettujen makrofagiprosenttien välillä kirjallisuuskatsauksessamme (Kuva. 4 A).

vertailua varten arvioimme analyysiemme välisiä eroja (vain SAT), joiden tulokset olivat suhteellisen vakaita, mikä osoittaa parempaa standardointia huolimatta osallistujien biologisista eroista ja mahdollisista eroista näytteiden käsittelyssä eri laboratorioiden välillä (täydentävä Kuva. S5). Jopa käyttämällä RNA-Seq-tason tietoja dekonvoluution suorittamiseen johti pienempään varianssiin kuin kirjallisuudesta raportoidut tutkimukset (Fig. 4, Täydentävä Kuva. S6).

kirjallisuusraportteihin verrattuna analyysimme makrofagien arvioitu määrä on spektrin alapäässä: keskimäärin 1,3% kokonaissoluista 616 SAT-näytteessä (mediaani 0,8%, IQR: 0,03% -1,8%) ja 1,2% kokonaissoluista 51 KAURANÄYTTEESSÄ (mediaani 1,2%, IQR: 0,4% -1,8%). Kun tarkastellaan ääripäitä, tuloksemme vahvistavat, että hyvin harvoissa tapauksissa on olemassa laaja valikoima makrofagikoostumuksia, joissa on jopa 25% makrofageja.

jotta voidaan selvittää monosyyttien mahdollinen vaikutus, jotka ilmaisevat myös kirjallisuustutkimuksissa käytettyjä merkkiaineita (CD14, CD68 ja HAM56), raportoimme myös makrofagien ja monosyyttien yhdistetyt fraktiot AT21-CIBERSORT-lähestymistavastamme. Tämä tarkoittaa keskimäärin 1,5% makrofageja/monosyyttejä SAT-näytteissä ja 4,3% makrofageja/monosyyttejä KAURANÄYTTEISSÄ, mikä tuo arviomme lähelle kirjallisuudessa ilmoitettuja keskiarvoja.

ACS-solujen määrä (keskiarvo 14, 8% SAT-ryhmässä ja 15, 7% kaurassa), CD4+ T-solujen määrä (keskiarvo 0, 9% SAT-ryhmässä ja 0.4% kaura), CD8+ T-soluja (keskiarvo 0,5% sekä SAT ja kaura) ja endoteelisoluja (keskiarvo 0,7% SAT ja 1,8% kaura) arvioimamme lähestymistapa on hyvin linjassa kirjallisuuden raportit (Kuva. 4B-E). Makrofagien tapaan ASC-määrien kirjallisuusraporteissa on suuria vaihteluja (Kuva. 4b). Olemme tunnistaneet kolme syytä, jotka selittävät tätä vaihtelua. Ensinnäkin kolmessa kirjallisuustutkimuksessa (tutkimukset s, t ja v – KS.lisätiedot S4) käytetään rasvaimun aspiraateista peräisin olevaa rasvakudosta, joka on saastunut verellä17, minkä seurauksena SVF: ssä on vähemmän ASCs: n suhteellisia fraktioita. Toiseksi, joissakin tutkimuksissa erotetaan endoteeliset progenitorit ja adventiaaliset rasvakantasolut (esim.tutkimukset u ja v), kun taas toisissa (mukaan lukien tutkimuksemme) ei, mahdollisesti lasketaan molemmat alapopulaatiot ASCs: ksi. Erityisesti, kun lasketaan yhteen kaksi alapopulaatioita tutkimuksessa Zimmerlin27, tuloksena keskimääräinen osuus 13.9% (harmaa piste Kuvassa. 4B) on lähellä arvioituja tuloksiamme. Kolmanneksi kokonaissolutuotos ja stroomasoluprosentti vaihtelevat suuresti SVF28,29: n eristämistavasta riippuen, mikä voi mahdollisesti selittää Viardot ’ n ja colleagues30: n raportoimat hyvin vähäiset luvut (tutkimus m).

on olemassa useita solutyyppejä, kuten plasmasytoidisia dendriittisoluja, neutrofiilejä tai eosinofiilejä, joista emme löytäneet kirjallisuudessa mitään tuloksia, joten raportoimme niiden esiintymistiheyden ihmisen rasvakudoksessa ensimmäistä kertaa. Jotkin solutyypit, kuten verihiutaleet ja punasolut, sisältyvät pääasiassa kontrollina AT21-merkkimatriisiin, mikä mahdollistaa veren esiintymisen tunnistamisen näytteissä.

viiteaineisto, jossa oli rasvakudoksesta eristettyjä solutyyppejä

at21-dekonvoluutiotulosten tarkempaa varmentamista varten, vertasimme niitä AT4-signatuurimatriisiin, joka koostuu rasvakudoksesta eristetyistä neljästä solufraktiosta.

sulkiaksemme pois erot tutkimuspopulaatiossa ja kudosnäytteenottomenetelmissä (säilyttäen erot solutyypin rakeisuudessa, vertailunäytteissä ja suorittaessamme monialustan analyysia) käytimme ex-vivo-viittausta Dekonvolvoimaan Affymetrix Human U133 Plus 2.0-ryhmän 779 rasvakudosnäytettä, jotka analysoimme aiemmin at21-allekirjoitusmatriisilla. Tuloksena soluprosentit (täydentävä Kuva. S7) ovat samaa luokkaa kuin at21: n avulla saadut tulokset (vaikka monosyytti / makrofagiprosentit ovat hieman korkeammat) ja korreloivat kohtuullisen hyvin niiden kanssa, paljastaen Spearmanin ja Pearsonin korrelaatiot välillä 0, 41-0, 87 (täydentävä Kuva. S8). Analyysimme kuitenkin osoittaa, että solutyyppien valinnalla ja niiden alkuperällä voi olla vaikutusta tulosten yksityiskohtaisuuteen, vaikka kokonaisjakauma säilyykin.

lisäarvioidaksemme dekonvoluutiotapaamme käytimme tätä ”ex-vivo” – referenssiä dekonvolvinäytteisiin, jotka koostuivat rasvakudoksen stroomaalisesta vaskulaarisesta fraktiosta (myös aineistosta GSE80654), paljastaen solutyypin jakauman, jossa on keskimäärin 53% varsi – /stroomasoluja, 27% monosyyttejä / makrofageja, 19% muita leukosyyttejä ja 1% adiposyyttejä (KS. S9)alkaen n = 6 yksilöä yhteensä n = 10. Jäljelle jääneiden neljän henkilön tietoja ei ollut saatavilla. Virtaussytometriatulokset raportoivat hieman erilaisia keskiarvoja: 62% runko – /stroomasoluja, 13% monosyyttejä / makrofageja, 12% muita leukosyyttejä, 3% endoteelisoluja, ~10% määrittelemättömiä), vaikka ne olivat peräisin suuremmasta otoskoosta N = 10 yksilöä alkuperäisessä tutkimuksessa31. Molemmat tulokset vahvistavat varren / stroomasolujen suuren määrän rasvakudoksessa ja (kun yksikkö on muunnettu SVF: n soluista rasvakudoksen soluiksi – KS.menetelmät) ovat kohtuullisen samanlaisia kuin keskimääräiset tuloksemme, joissa at21: tä sovelletaan rasvakudokseen, kun otetaan huomioon erot tutkimuspopulaatiossa, rasvakudoksen näytteenottomenetelmät ja solutyypin eron rakeisuus (4 vs. 21 solutyyppiä).

neljän rasvakudosvaraston Vertailu

seuraavaksi vertaamme neljän rasvakudosvaraston (SAT, kaura, PAT ja EAT) solutyyppikoostumusta ilmoittamalla niiden keskimääräisen solutyyppikoostumuksen (Fig. 5, yksityiskohtaisesti täydentävässä Kuvassa. S4). Tämä osoittaa, että SAT on korkein osuus adiposyyttien (74%) seuraa kaura (66,4%), syödä (59,5%) ja PAT (59,4%), kun taas syödä ja PAT on paljon enemmän immuunisoluja (20,8% ja 20,9%, vastaavasti) verrattuna kaura (9,8%) ja SAT (7,4%). Lisäksi kaura on rikkain lähde varsi / stroomasoluja (17,2% verrattuna 14,9% SAT, 14.1% EATILLE ja 12,4% PATILLE).

arvioitu solutyyppien prosenttiosuus Rasvavarastoa kohti: (A) Pie – kaavio, joka osoittaa eri rasvakudosvarastojen solutyyppijakauman (subkutaaninen – n = 616, odental – n = 51, perikardiaalinen – n = 66 ja epikardiaalinen-n = 46) rasvakudoksen solujen neljän tärkeimmän arkkityypin osalta (immuunisolut, varsi – /stroomasolut, adiposyytit ja muut). B) viivakaaviot, joista käy ilmi immuunijärjestelmän soluosaston yksityiskohtainen jakautuminen kustakin rasvakudosvarastosta. Kaikki arvot ovat kunkin varikon analysoitujen näytteiden keskiarvoja.

näitä tuloksia on tulkittava varoen niiden ihmisten lukumäärän ja ominaisuuksien erojen vuoksi, joilta näytteet on kerätty. Ravinnon ja Patin saanti on rajallista niiden fysiologisen sijainnin ja näytteenottomenettelyn invasiivisuuden vuoksi. Siksi PAT-näytteet otettiin 66 potilaalta (Ikä: 66 ± 8 vuotta), joilla oli sepelvaltimotauti (CAD)32, ja EAT-näytteet otettiin 11 vastasyntyneestä (6-24 päivän ikäinen), 28 imeväisestä (40 päivän-1 vuoden ikäinen) ja 7 lapsesta (2-7-vuotias), joilla oli synnynnäinen sydänsairaus (CHD)33.

eatin ja Patin luovuttajien ikäeroista huolimatta eatin ja Patin immuunisolun arkkityypin koostumus muistuttaa huomattavan paljon toisiaan, mutta on kuitenkin hyvin erilainen kuin SAT-ja KAURANÄYTTEISSÄ. Tämä osoittaa tulosten luotettavuuden sekä solutyypin koostumuksen säilymisen näissä kahdessa sydäntä ympäröivässä rasvakudosvarastossa.

lisäksi raportoimme klassisesti nimettyjen ”adaptiivisten” immuunisolujen, kuten B-solujen, CD8+ – ja CD4+ T-solujen, fraktiot, jotka ovat tunkeutuneet EAT-ja PAT-soluihin. Nämä mukautuva immuunisolut ovat rikastettu EAT ja Pat, (korkeampi PAT kuin EAT) verrattuna SAT ja kaura varastot, mikä voisi todennäköisesti johtua alkuperän analysoitu näytteitä potilaiden CAD tai CHD, kuten raportoitu aiemmin CD8+ T cells34. Löydöstämme tukevat myös Mazurek ja colleagues35, jotka vertailivat sytokiinien ilmentymistä sekä syö-että SAT-potilailla sepelvaltimon ohitusleikkauksessa ja havaitsivat, että syö on useiden tulehdusvälittäjien lähde.

SAT: n ja kauran tarkempi vertailu tehtiin Hardy et al: n tutkimuksessa. 2011 (tietokokonaisuus GSE20950), jossa molemmat varikot olivat saatavilla samoilta henkilöiltä25. Tämä analyysi paljasti lisääntynyt neutrofiilien pitoisuus SAT (myös korjaamisen jälkeen useita testejä) ja lisääntynyt mesenkymaalinen varsi/stroomasolujen ja sileän lihassolujen pitoisuus kauran (Kuva. 6 A). Soluista johdettujen neutrofiilien (cyp4f3) sekä perikardiaalisten adiposyyttien (C7) ja subkutaanisten adiposyyttien (CMA1) merkkiaineiden tutkimus vahvisti merkittävän eron SAT: n ja kauran välillä näissä solutyypeissä (myös sen jälkeen, kun niitä on muutettu useita testejä varten).

rasvakudoksen koostumus Fenotyyppisissä piirteissä: (A) Heatmap osoittaa merkitsevän yli (punainen)/alle (sininen) edustavan solutyyppiä eri luokissa perustuu Z-pisteytykseen (ilmoittaa keskihajontojen määrän, joka on kunkin ryhmän päässä toisistaan). Vain merkittävät tulokset (korjaamaton p < 0, 05) ovat värillisiä. Tähdet merkitsevät tulokset, jotka pysyvät merkittävinä useiden testien korjauksen jälkeen. Papualat, joissa näkyy (b) kaikki merkittävät solutyypit ja (C) ASCs ja subkutaaniset adiposyytit (ei havaittu merkitsevinä) raskaammassa ja kevyemmässä kaksostutkimuksessa, discordant-tutkimuksessa. Y-akseli kuvaa arvioitujen solujakeiden eroja raskaamman ja kevyemmän kaksosen välillä kaksosparin sisällä.

solutyypin koostumus fenotyyppisten ominaisuuksien osalta

lopuksi vertailimme rasvakudoksen solutyypin koostumusta yksilöiden välillä, joilla oli erilaisia fenotyyppisiä piirteitä, kuten eri sukupuoli, ikä, painoindeksi (BMI) ja tyypin 2 diabeteksen eri kehitysvaiheet. Lisäksi sisällytimme interventiotutkimuksia, joissa tutkittiin kalorien rajoittamisen tai resveratrolin nauttimisen vaikutusta SAT-solutyypin koostumukseen. Näiden analyysien tulokset on esitetty Fig. 6 ja yksityiskohtaisemmin täydentävässä Kuvassa. S10 ja lisätiedot S5.

havaitsimme merkittäviä eroja SAT-solujen koostumuksessa urosten ja naaraiden välillä, mikä viittaa siihen, että plasmasytoidien dendriittisoluja, CD4+ T-soluja, verihiutaleita ja kondrosyyttejä on naisilla enemmän, kun taas uroksilla on enemmän CD8+ T-soluja, fibroblasteja ja endoteelisoluja. Erot CD4+-ja CD8 + T-soluissa olivat merkittäviä myös useiden testien korjaamisen jälkeen, mutta niitä ei havaittu yksittäisten vakiintuneiden tai Soluvalmisteisten merkkiaineiden perusteella. Iän suhteen havaitsimme vain yhden merkittävän tuloksen, joka viittaa suurempaan fibroblastien määrään iän kasvaessa.

mukana on neljä BMI: hen liittyvää vertailua: I) BMI: n jatkuva suhde SAT: n solujakeisiin, II) SAT: n solukoostumuksen vertailu konkordanteilla monotsygoottisilla kaksosilla (raskaammat vs. leaner twin, ∆BMI < 3 kg/m2), iii) sama discordanteilla monotsygoottisilla kaksosilla (raskaammat vs. leaner twin, ∆BMI > 3 kg/m2), ja (IV) kauran solukoostumuksen vertailu lihavilla ja laihoilla lapsilla. Ensimmäinen vertailu osoittaa, että BMI korreloi positiivisesti monosyyttien, myeloidisten dendriittisolujen, verihiutaleiden, osteoblastien, kondrosyyttien ja ASCs: ien määrän kanssa SAT: ssa, kun taas korrelaatio ihonalaisen adiposyyttien kanssa on negatiivinen. Konkordanttikaksosten välillä ei ole merkittäviä eroja, kun taas riitasointuiset kaksoset eroavat toisistaan merkittävästi CD4+ T-solujen, erytroblastien, osteoblastien (kaikki suurempia raskaammilla kaksosilla) sekä B-solujen (korkeammat heikommilla kaksosilla) määrässä (Fig. 6b). Erityisesti, on taipumus kohti suurempia määriä ASCs ja pienempi määrä adiposyyttien raskaammat kaksoset (Kuva. 6C), joka tukee vastaavaa merkittävää havaintoa jatkuvassa yhteydessä BMI: hen. Sen sijaan kaksostutkimuksessa ei havaita joitakin muita havaintoja jatkuvasta yhteydestä painoindeksiin, mikä voi johtua jatkuvassa yhteydessä mahdollisesti esiintyvistä sekoittavista vaikutuksista (ikä, sukupuoli tai muut tekijät).

merkittävien tulosten puuttuminen lean vs. ylipainoiset lapset johtuvat useimmiten rajallisesta tehosta, sillä tutkimuksessa oli mukana vain yhteensä 11 näytettä (5 lihavaa ja 6 laihaa lasta).

teimme kuusi vertailua, jotka liittyivät diabetekseen, glukoosinsietoon tai insuliiniresistenssiin. Kolmesta potilaasta (heikentynyt glukoosinsietokyky SAT: ssa, heikentynyt glukoosinsietokyky SAT: ssa, diabetes mellitus SAT: ssa heikentynyt glukoosinsietokyky kaurassa ja insuliiniresistentti herkkä kaurassa) ei saatu tilastollisesti merkitseviä tuloksia. SAT-solutyypin koostumuksen vertailu insuliiniresistenteillä vs. herkillä yksilöillä sileiden lihassolujen määrä lisääntyi merkittävästi insuliiniresistenteillä henkilöillä. SAT ihmisten diabetes mellitus sisältää enemmän monosyyttejä ja vähemmän eosinofiilien kuin normaalin glukoosi suvaitsevaisia ihmisiä, mukaan analyysimme, kun taas kaura sairaalloisen lihavia ihmisiä osoittaa eroja myelooinen dendritic soluja, eosinofiilit (molemmat korkeampi diabeetikoilla), ja kondrosyytit (korkeampi ihmisillä ilman diabetesta).

Emme löytäneet todisteita siitä, että kalorien rajoittaminen tai resveratrolilisäys muuttaisi merkittävästi rasvakudoksen solutyypin koostumusta.

mielenkiintoista on, että yhdessä mukana olleessa tutkimuksessa raportoitiin myös makrofagiprosentit immunohistokemiallisella menetelmällä 25 (GSE20950) määritettynä. Ne osoittavat makrofagitaajuudet 11 KAURANÄYTTEELLE (20: stä tutkimukseen osallistuneesta) insuliiniherkiltä ja insuliiniresistenteiltä ihmisiltä, joiden keskimääräinen makrofagipitoisuus on 1,8% (yksikkömuunnoksen jälkeen % kokonaissoluista), mikä vastaa hienosti arviotamme 1.495% kaikista 20 osallistujasta (11 näytteen immunohistokemian valintakriteerit eivät sisältyneet tutkimuskuvaukseen). Lisäksi he raportoivat merkittävän yhteyden HOMA-IR-ja makrofagipitoisuuksien välillä näillä 11 henkilöllä, minkä osittain vahvistamme rajatulla merkityksellä (p-arvo 0, 054), kun verrataan insuliiniresistenttejä ja insuliiniherkkiä ihmisiä Kaikissa 20 tutkimukseen osallistuneessa.