Rotation drevet af ATP-hydrolyse

den hydrolytiske rotationscyklus består af tre 120o-trin i det katalytiske F1-domæne, defineret i biofysiske rotationsforsøg med “katalytiske boliger” . Hvert 120o-trin er opdelt i undertrin defineret af en katalytisk ophold efter hvert 120o-trin med en mellemliggende “ATP-binding” dvæle ved 30o og en “fosfatfrigivelse” dvæle ved 95o. Frigivelse af fosfat gør det muligt at fuldføre 120o-trinnet og nå frem til ATP-bindingsboligen. Vi har beskrevet strukturerne i det F1-katalytiske domæne ved fosfatfrigivelsen og katalytiske boliger, og har vist, at det 35O roterende undertrin mellem fosfatfrigivelse og katalytiske boliger afhænger af frigivelsen af fosfat fra “ATP-bindingen” – boligen, som derefter tillader det at gå videre til det “katalytiske ophold” . Den katalytiske bor i sig selv repræsenterer en overgang, hvor et bundet ATP-molekyle bliver klar til hydrolyse. Vores nuværende indsats er centreret omkring at definere den katalytiske dvæle i encefalopati F1-ATPase.

Filmens Generation af 30o rotation af γ-subunit i encephalopati F1-ATPase ved frigivelse af fosfat fra ßE-enhed. Filmen begynder med en visning fra siden af F1-ThioP i båndrepræsentation med det bundne thiophosphat som orange kugler. Underenhederne er henholdsvis røde og gule. Derefter, aTP-, aDP-, ßTP – og ßDP-underenheder er fjernet sekventielt forlader aEßE-dimer og den centrale stilk underenheder γ, δ og ε (blå, lilla og grønne, henholdsvis). Dette resterende underkompleks drejes til højre omkring y-aksen med 100 liter for at afsløre et sidebillede af aE-underenheden og den centrale stilk. Derefter fjernes underenhederne og resterne af underenhederne og resterne af underenheden, og underenheden bliver svagere. I de sidste rammer frigives det bundne fosfat, og aE-underenheden åbnes og bevæger sig væk fra kolon-underenheden, hvilket forstyrrer pakningsinteraktioner mellem aE – og kolon-underenhederne. For at genetablere disse interaktioner roterer en underenhed med 30. Strukturen af den endelige tilstand er postphosphatfrigivelsestilstanden for bovin F1-ATPase fundet i F1-i3-ThioP.

Rotation drevet af pmf

nøglen mangler datum for at forstå genereringen af rotation fra pmf er den detaljerede struktur på atomniveau af den vej, protonerne tager gennem membrandomænet. Den bedste tilgængelige struktur til dato er den, som vi bestemte ved 4-opløsning i 2015 ved røntgenkrystallografi af komplekset fra Paracoccus denitrificans . Andre blev bestemt i 2015 og 2016 ved cryo-elektronmikroskopi af enkelte partikler af kvæg og svampe, i bedste fald ved 6 liter opløsning . Imidlertid mangler disse modeller alle de detaljer, der kræves til formulering af en molekylær mekanisme til generering af rotation fra proton-drivkraften, og på grund af motiliteten og fleksibiliteten kan enkelte partikler i ensymet indtage mange forskellige positioner. Derfor udgør det et usædvanligt vanskeligt problem for cryo-em-tilgangen.

figur membrandomænet for F-ATPase fra P. angusta. I A-D er a-underenheden majsblomst blå. A og B, synspunkter i solid repræsentation fra siden og under membrandomænet. C10-ringen er grå, b-underenheden (øverste del ikke vist) er lyserød, og de lysegule, mursten-røde, lette cyan-og beige segmenter er transmembrane kur-helices, Ch1-Ch4 tildelt henholdsvis underenhed f, atp8, aH1 og bH1. I c-ringen, i-IV angiver de fire transmembrane C-terminale Kris-helices i kontakt med underenhed a. C og D, visninger af a-underenheden i solid og tegneseriepræsentation set udefra og kigger ud fra grænsefladen med c-ringen, henholdsvis, med aH1 i bleg cyan. Konserverede polære rester er gule, positionerne af humane mutationer forbundet med patologier (se tabel S1) er røde. Den lyserøde kugle betegner den konserverede Arg-179 i aH5, der er essentiel for protontranslokation. Den nederste pil angiver indløbsvejen for protoner, der overføres til Glu-59 i c-terminalens C-terminal-spiral-II af c-ringen. De bæres rundt om ringen ved rotation mod uret set ovenfra, indtil de ankommer til Arg-179, hvor de kommer ind i udgangsvejen, betegnet med den øverste pil.

strukturer af bakterielle ATP-syntaser

figur bakterielle ATP-syntaser. (A) F1-ATPase fra Caldalkalibacillus thermarum ved 2,6 liter opløsning ved røntgenkrystallografi; (B) ATP-syntase fra Paracoccus denitrificans ved 4 liter opløsning ved røntgenkrystallografi; (C) ATP-syntase fra Escherichia coli ved 7 liter opløsning ved cryo-EM.

i forhold til de omfattende undersøgelser, som vi har udført på mitokondrielle stoffer, er strukturerne af bakterielle ATP-syntaser blevet undersøgt lidt, bortset fra strukturer af F1-katalytiske domæner fra Escherichia coli og Geobacillus stearothermophilus (tidligere Bacillus stearothermophilus) ved henholdsvis 3,2 og 3,9 liter opløsning og strukturer af c-ringene fra deres membrandomæner fra forskellige arter . For at udfylde denne lakuna har vi indtil videre bidraget med strukturen af hele paracoccus Denitrificans ved 4-opløsning og i samarbejde med Professor G. M. Cook og kolleger i Dunedin, ny Sjælland , strukturerne af de F1-katalytiske domæner i ATP-syntaserne fra Caldalkalibacillus thermarum, Fusobacterium nucleatum og Mycobacterium smegmatis. C. thermarum er en termoalkalifil, og strukturen af dets katalytiske domæne ved 2,6 liter opløsning er den mest nøjagtige struktur af en bakteriel F1-ATPase, der endnu er bestemt . Den er fra M. smegmatis er nært beslægtet med M. tuberculosis. Strukturen af dets katalytiske domæne er blevet bestemt til 4-opløsning og giver et mål for udvikling af nye anti-tuberkulære lægemidler . Det opportunistiske periodontale patogen, Fusobacterium nucleatum, er forbundet med en lang række sygdomme, herunder orale infektioner, fremskridt med graviditetsresultater, gastrointestinale sygdomme og aterosklerose. Det har også været forbundet med udvikling og progression af kolorektal cancer via hæmning af anti-tumor immun signalveje og efterfølgende fremme af kemoresistens. Det er en obligatorisk anaerobe og parrer den frie energi fra dekarboksylering af glutaconyl-CoA til crotonyl-CoA til transport af Na+ ioner over dens cellulære membran for at generere en natriumionmotivkraft (smf). ATP-syntasen bruger smf til at drive syntesen af ATP, der kræves til kataboliske og anabolske reaktioner. Strukturen af dets F1-katalytiske domæne er bestemt ved 3,6 liter opløsning . Ved hjælp af cryo-EM er der blevet offentliggjort et kort over den intakte ATP-syntase af E. coli , der viser kur-underenheden i “op” – positionen (se nedenfor), og for nylig er en struktur af ATP-syntasen fra Geobacillus stearothermophilus blevet bestemt til 3 kur .

struktur af parasit ATP-syntaser

figur F1-ATPase fra Trypanosoma brucei. Underenhederne er henholdsvis røde, gule, blå, grønne, magenta og cyan. (A og B) tegneserie repræsentationer af den side og top synspunkter; (C-E) overflade repræsentationer af (C), bovin F1-ATPase, (D), T. med P18 fjernet og de farvede sektioner, der viser aminosyrerne yderligere til Kvæget, og (E), T. brucei med p18 til stede.

strukturerne og funktionerne af komponenterne i ATP-syntaser, især de underenheder, der er involveret direkte i den katalytiske dannelse af ATP, er bredt konserveret i metaser, svampe, eubakterier og plantekloroplaster. På grundlag af et kort på 32.5. opløsning bestemt in situ i mitokondrier af den euglenosoiske parasit, Trypanosoma brucei, ved elektron cryo-tomografi, er det blevet foreslået, at ATP-syntasen i denne art har en ikke-kanonisk struktur med forskellige katalytiske steder, hvor den katalytisk essentielle argininfinger tilvejebringes, ikke af den Kris-underenhed, der støder op til det katalytiske nukleotidbindingssted, som i alle arter, der er undersøgt til dato, men af et protein kaldet p18, der kun findes i euglenosen . I et samarbejde med Drs Alena Zíková og Ondřej Gahura fra Institut for Parasitologi i České Budějovice i den tjekkiske Republik, vi har karakteriseret F1-ATPase fra T. brucei og bestemt en krystal struktur af enzymet på 3,2 Å beslutning . Denne struktur viser, at forslaget om, at det katalytiske domæne for denne ATP-syntase har en ikke-kanonisk struktur og forskellige katalytiske steder, er forkert. I mange henseender ligner strukturen af T. brucei F1-ATPase tæt på dem af F1-atpaser bestemt tidligere. Den kurt3-sfæriske del af det katalytiske domæne, hvor de tre katalytiske steder findes, plus den centrale stilk, er stærkt konserverede, og argininfingeren tilvejebringes konventionelt af Kurt-underenhederne ved siden af hvert af de tre katalytiske steder, der findes i Kurt-underenhederne. Det har således en konventionel katalytisk mekanisme. Strukturen adskiller sig fra tidligere ved at have en p18-underenhed, der kun er identificeret i euglenosoen, der er forbundet med den ydre overflade af hver af de tre kurp-underenheder og derved uddyber F1-domænet. Underenhed p18 er et pentatricopeptid repeat (PPR) protein med tre PPRs og synes ikke at have nogen funktion i den katalytiske mekanisme. T. brucei er det forårsagende middel til sovesyge hos mennesker og beslægtede sygdomme hos husdyr, der lever i Afrika syd for Sahara, og strukturen af dets F1-atpaser giver et mål for udvikling af nye lægemidler til behandling af sygdommen.

cardiolipins rolle

det anioniske lipidkardiolipin er en væsentlig bestanddel af aktive ATP-syntaser. I metasoere indeholder deres rotorer en ring på otte c – underenheder bestående af henholdsvis indre og ydre cirkler af N-og C-terminale Kurt-helices. Begyndelsen af den C-terminale C-spiral indeholder en strengt konserveret og fuldt trimethyleret lysinrest i membranets lipidhovedgruppeområde. Større ringe med kendt struktur, fra c9-c15 i eubakterier og kloroplaster, bevarer enten en lysin eller en argininrest i ækvivalent position. I computersimuleringer af hydratiserede membraner indeholdende trimethylerede eller umethylerede kvæg c8-ringe og bakterielle c10 – eller c11-ringe blev hovedgrupperne af cardiolipinmolekyler selektivt forbundet med disse modificerede og umodificerede lysinrester og med tilstødende polære aminosyrer og med en anden konserveret lysin på den modsatte side af membranen, hvorimod phosphatidyllipider blev tiltrukket lidt til disse steder .

figur former for binding af cardiolipin til trimethylerede c8-ringe. C-underenhedernes n-og C-terminale k-helices er henholdsvis mørke og lysegrå. Cardiolipinmolekyler er grønne med lyserøde fosfatgrupper. Store farvede kugler repræsenterer de grove kornperler for specifikke aminosyrer, som angivet, der ligger inden for 0,7 nm af phosphatperlerne af cardiolipin. Del A og B, hovedgruppeområdet af cardiolipin i den indre folder af membranen bundet henholdsvis til to tilstødende c-underenheder (underenheder 8 og 1) og til en enkelt c-underenhed; del C, et cardiolipinmolekyle i den ydre folder af membranen bundet til en enkelt c-underenhed. men opholdstiderne for cardiolipinmolekyler med ringen var korte og tilstrækkelige til, at rotoren kun kunne dreje en brøkdel af en grad i det aktive stof. Med den demethylerede c8-ring og med c10 – og c11-ringe steg tætheden af bundne cardiolipinmolekyler på dette sted, men opholdstiderne blev ikke ændret meget. Disse meget specifikke, men korte interaktioner med den roterende C-ring er i overensstemmelse med funktionelle roller for cardiolipin til stabilisering og smøring af rotoren, og, ved at interagere med fermembranen ved indløb og udgang af transmembran protonkanal, i deltagelse i protontranslokation gennem membrandomænet af fermembranen.

film simulering af interaktion af cardiolipin med den indfødte bovin C8-ring. Protein rygrad er vist i lysegrå, med sidekæder af Lys-43 (rød), Gln-44 (gul), Gln-45 (blå) og Ser-48 (cyan) vist som kugler. Cardiolipinmolekyler vises som grønne pinde med fosfater som lyserøde kugler; POPC-og POPE-molekyler vises som mørkegrå pinde med fosfater som mørkegrå kugler.