beskrivelse og generelle noter

restriktionsendonukleaser (REs) er bakterielle stoffer, der spalter dobbeltstrenget DNA. Type i REs er vigtige i bakteriefunktion, men spalter ikke DNA ved specifikke sekvenser. Type II REs, beskrevet til brug i denne vejledning, kræver meget specifikke steder til DNA-spaltning og er således yderst nyttige værktøjer inden for molekylærbiologi. De tillader kloning og oprensning af definerede DNA-fragmenter. De omkring 500 kendte REs er typisk isoleret fra en række bakteriestammer.

REs er til stede i bakterier formodentlig for at ødelægge DNA fra fremmede kilder (f.eks. inficere bakteriofag) ved at spalte det fremmede DNA på specifikke genkendelsessteder. Værtsbakteriernes DNA er beskyttet mod spaltning, fordi de specifikke genkendelsessteder modificeres, normalt ved methylering ved en af baserne på stedet, hvilket gør stedet ikke længere et substrat til re-spaltning. Praktisk set er REs med forskellige genkendelsesstedsspecifikationer blevet oprenset fra forskellige bakteriestammer og anvendes af molekylærbiologer under definerede betingelser til at spalte oprenset DNA fra eukaryote kilder til definerede fragmenter i en in vitro-reaktion. Værtsbakterier, der bruges til at udbrede klonet DNA i laboratoriet, er normalt mutante i værtsrestriktionsgenerne (hsdR, hsdM eller HSD ‘ er); således vil deres intracellulære aktiviteter ikke ødelægge de fremmede rekombinante sekvenser.

disse ender er komplementære (“sticky”) og kan fastgøres igen til enhver anden EcoRI-genereret Termini ved hjælp af T4 DNA ligase. Andre REs genkender forskellige sekvenser og foretager unikke spaltninger, hvilket resulterer i andre definerede termini, hvoraf nogle også har 5′ fremspringende ender, 3′ fremspringende ender eller ingen fremspringende (stumpe) ender (Se tabel 5.1). Hver RE har en specifik sekvens og antal nukleotider, der kræves for at oprette genkendelsesstedet. Nogle REs kræver ikke et specifikt nukleotid i hver position på genkendelsesstedet. For eksempel er i nogle tilfælde et purinnukleotid (a eller G) i en defineret position tilstrækkelig. Frekvensen, hvormed en RE vil skære DNA, er således relateret til antallet af baser i genkendelsessekvenserne (hvis der kræves flere baser, er færre nedskæringer egnede til at blive foretaget) og de specifikke baser i enhver position.

REs er nyttige, fordi deres specificitet og de resulterende ligatable termini tillader dissektion, analyse og omstrukturering af DNA på en kontrolleret, forudsigelig, stedsspecifik måde. Fordi de er forskellige, har hver især specifikke krav til forhold, der fører til optimal spaltningsaktivitet. Heldigvis er mange aktive under lignende forhold, hvor den primære variabel er ionisk styrke (dvs.NaCl i bufferen). Praktiske forhold er empirisk defineret for at bruge hver RE som et forskningsværktøj.

mængden af reaktivitet defineres normalt ikke ved hjælp af klassisk kinetik. Snarere defineres reaktivitet i praktiske termer til brug i laboratoriet. En enhed (u) af aktivitet for en RE er normalt defineret som den mængde, der vil skære 1 liter på alle specifikke steder i en DNA-prøve (normalt bakteriofag-liter) i 1 time ved 37 liter C. Den faktiske aktivitet opnået kan være anderledes, hvis yderligere re fordøjelse steder er til stede. For eksempel, hvis 1 U af en RE er tilstrækkelig til at skære 1 liter bakteriofag-DNA fuldstændigt på et sted under standardanalysebetingelser, det er muligvis ikke i stand til at skære fuldstændigt 1 liter af en DNA-prøve, der har fire steder til EN RE, eller en prøve, der ikke er blevet tilstrækkeligt oprenset.

andre faktorer vedrørende reaktionsbetingelserne påvirker også reaktivitet. Disse omfatter renhed af DNA, buffer, temperaturforhold og selve RE. DNA-methylering, bundet protein eller overdreven viskositet af DNA med høj molekylvægt i viskøse opløsninger kan nedsætte effektiviteten af en re-fordøjelse. DNA ‘ et, der skal skæres, skal normalt være fri for urenheder; SS-phenol/chloroformekstraktion og ethanoludfældning (afsnit 20-1) fjerner mange interfererende urenheder. I modsætning hertil påvirkes de fleste REs normalt ikke negativt af RNA eller enkeltstrenget DNA. Tilsætningen af tRNA som coprecipitant kan således være nyttig til at genvinde små mængder DNA uden at påvirke efterfølgende re-fordøjelser.

den typiske analysebetingelse for en RE-reaktion indeholder en buffer (10 mM Tris, pH 7,4 er almindelig), 10 mM Mg2+ og er fri for betydelige koncentrationer af chelateringsmidler (TE-buffer indeholder en tilstrækkelig lav mængde EDTA). RE-bufferne indeholder også passende saltkoncentrationer for at give den optimale Ioniske styrke for hver RE. I nogle tilfælde tilsættes BSA, DTT og spermidin for at give optimal aktivitet. Fire generaliserede re buffere kan opfylde kravene til de fleste REs, og forskud forberedelse af 10 liter lagre af disse buffere er beskrevet nedenfor. De fleste re fordøjelser udføres på 37 kr., selv om der er et par undtagelser, såsom Taki.

de fleste købte REs leveres med en passende lagringsbuffer, men dette indeholder 25-50% glycerol for at forhindre frysning under opbevaring ved -20 liter C. koncentrationer af glycerol på over 5% (vol/vol) i re-fordøjelsesanalyser kan hæmme aktiviteten af mange REs. derudover kan høje glycerolkoncentrationer under re-fordøjelse slappe af sekvensspecificiteten af nogle REs, hvilket resulterer i falske spaltninger. For eksempel ses dette fænomen med den almindeligt anvendte RE EcoRI, hvor den falske aktivitet observeret under nogle betingelser kaldes EcoRI* (stjerne) aktivitet. Af disse grunde er det vigtigt at gøre volumenet af re-fordøjelsesreaktionen stort nok til at omfatte mindst en 1:10 fortynding af selve RE (og således reducere glycerolkoncentrationen). Andre faktorer, såsom pH, ethanol eller forkert saltkoncentration kan også forårsage stjerneaktivitet eller nedsat aktivitet; derfor er omhyggelig overholdelse af anbefalede forhold vigtig.

et par andre overvejelser er nyttige, når du bruger REs. brug en ny pipettespids hver gang en RE overføres. Spormængder af forurenende stof tilsat til RE-bestanden kan forhindre dets videre anvendelse og forvirre resultater opnået i efterfølgende forsøg. Ved optimering af reaktioner er det bedre at tilføje yderligere RE end at inkubere i meget længere tid end 1 time. Fordi din prøve generelt er meget forskellig fra standarden, er en god vejledning at bruge omkring 2-3 U RE pr.mikrogram DNA, der skal skæres, især når man forsøger at fordøje en vanskelig prøve. Det kan undertiden være nødvendigt at titrere den mængde RE, der er nødvendig for at fordøje en DNA-prøve korrekt.

endelig skal der tages hensyn til de optimale saltbetingelser for hver, hvis der skal anvendes to REs. Hvis begge kræver den samme buffer, kan fordøjelsen ske enten samtidigt eller sekventielt. Hvis der kræves forskellige saltbetingelser, skal den RE, der kræver mindre salt, først bruges. Efter inkubation justere salt tilstand, og fordøje med RE kræver højt salt. Reaktivitet kan fjernes ved SS-phenol / chloroformekstraktion i alle tilfælde. Nogle REs er termolabile og kan inaktiveres ved opvarmning til 70 liter C i 5 minutter. Denne egenskab, imidlertid, varierer fra den ene RE til den næste og bør verificeres for hver re brugt.