obr. 2. Medulla oblongata; pes. Oblast na středové čáře medulla ukazuje mnoho oteklých axonů (sféroidů) označených šipkami, obklopující oblast nekrózy s krvácením a makrofágy. On skvrna. Tyč = 70 µm.

Polymerázová řetězová reakce (PCR) pro WNV byla provedena na pevné mozku a odpojil míchy, jater a ledvin. Kousky formalin-fixed mozek o hmotnosti 30 až 100 mg byly odstraněny z prodloužené míchy v blízkosti lesioned stránek a různých jiných místech v mozkového kmene, mozková kůra, mozeček, opláchnout vodou, a se umístil v RNAlater™ reagent (QIAgen, Valencia, CA) po dobu nejméně 1 hodinu před RNA extrakce. Vzorky zmrazené nefixované míchy, ledvin a jater byly extrahovány bez předběžného zpracování. Vzorky tkáně byly přerušeny pomocí motorových paličkou (PelletPestle, Kontes, Vineland, NJ) a RNA byla extrahována pomocí Trizol™ reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) nebo RNea-sy™ mini spin kolony (QIAgen) podle instrukcí výrobce. Reverzní transkriptáza-vnořená polymerázová řetězová reakce (rtnPCR) byla provedena za použití vnořených primerů a modifikace metody popsané Johnsonem et al., 12 s komerčními sadami činidel (OneStep™ RT PCR, Qiagen, Valencia, CA a Taq SuperPak™, Sigma, St. Louis, MO). Pozitivní kontrola byla 1 : 1,000 ředění sdružených RNA extrahované z upevněné WNV-pozitivní influenza tkání (zejména ledvin a mozku). Pásy DNA byly detekovány po elektroforéze agarózového gelu pomocí GelStar (Cambrex, East Rutherford, NJ). Tři z pěti kusů formalin-fixed dřeně byly pozitivní na rtnPCR, vzhledem k tomu, že všechny ostatní vzorky pevných mozku (mozkové kůře, mozečku a mozkového kmene) a upevněné (mražené), míchu, ledviny a játra byly negativní.

imunohistochemie (IHC) byla provedena ve snaze prokázat WNV antigen. Sekce formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tkání byly sníženy na 5 µm a obarveny pomocí autostainer (Dako, Carpinteria, CA) a balených streptavidin–biotin–peroxidáza detekční činidla (LSAB2, Dako), podle pokynů výrobce. Části mozku, ledvin, slinivky břišní, jater, srdce, sleziny, nadledvinek, a jazyk byly obarveny pomocí myší polyklonální protilátky k WNV (VR-1267-AF, ATCC, Manassas, VA) po předčištění s proteinázu K (Dako). Tato polyklonální protilátka vykazovala mírné difúzní zbarvení pozadí ve všech tkáních, což komplikuje interpretaci. Žádné specifické barvení bylo vidět, s možnou výjimkou v mozku, kde neurony difuzně ukázal, rovnoměrné světlo cytoplazmatické barvení ve srovnání s kontrolní sklíčka potřísněné irelevantní monoklonální IgG1. Výsledky byly považovány za nejednoznačné kvůli vysokému zbarvení pozadí a difúzní povaze barvení neuronů, s malou změnou intenzity. Tyto výsledky naznačují nedostatek antigenu v mozku psa, ve srovnání s infikovanými ptačími tkáněmi, kde bylo pozorováno robustní cytoplazmatické barvení.

části mozku byly také obarveny pomocí monoklonální protilátky proti nukleoproteinu viru psinky (CDV-NP ,VMRD, Pullman, WA) s negativními výsledky. IHC na mozku FFPE pro virus vztekliny byl proveden v jiné laboratoři (Prairie Diagnostic Service, Saskatoon, SK, Kanada) s negativními výsledky.

ačkoli fatální encefalitida způsobená WNV je dobře zdokumentována u mnoha druhů ptáků, 22 koní,8 a lidí, 20 klinických příznaků onemocnění způsobených tímto virem bylo u psů zřídka dokumentováno. V oblastech, kde je WNV endemický, vysoká prevalence specifické neutralizační protilátky naznačuje, že infekce u psů je běžná, i když klinické onemocnění není. Jeden sérosurvey z Jižní Afriky, kde je WNV endemický, ukázal, že 37% psů mělo neutralizační protilátky proti WNV.5 serosurvey v New Yorku hned po prvním identifikace WNV v západní polokouli, ukázala, že vyšší procento psů (10%) než koně (3%) nebo lidé (2.5%) specifické neutralizační protilátky v blízkosti epicentra nákazy (Queens).15 předchozí zpráva z Jižní Afriky popsala izolaci viru, později identifikovaného jako WNV, z mozku psa se závažnými klinickými příznaky encefalitidy.Této částky bylo 7,21 V jednom experimentu, infekce tři psi s WNV vyrábí asymptomatické sérokonverze ve všech třech, ale měřitelné virózy pouze v jedné z těchto zvířat, které bylo později zjištěno, že trpí hyperadrenokorticismem.5 novější studie s použitím amerického kmene prokázala nízkou hladinu virémie u všech čtyř infikovaných psů a osmi koček,2 bez klinických příznaků u psů a pouze mírné přechodné febrilní onemocnění u koček.

byly publikovány dvě současné zprávy o těžké infekci WNV u amerických psů. Buckweitz a kol. popsané posmrtné důkazy WNV replikace v mnoha tkáních, 11-rok-starý, pes, smíšené plemeno psa s poruchou funkce ledvin a centrálního nervového systému (CNS) onemocnění; kvantitativní reverzní transkriptáza–polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) zjistili, že virové sekvence byly nejhojnější v ledvinách, následuje srdce, mozku, plic a sleziny.6 Lichtensteiger et al. popište postmortální nálezy po euthanatization 8-rok-starý, smíšené plemeno psa s těžkým somatických onemocnění, která zahrnovala myokarditida, stejně jako fatální WNV encefalitidy v 3-měsíc-starý wolf pup.18 obě tyto zprávy dokumentovaly antigen a genetické sekvence WNV za použití IHC a RT-PCR ve více extraneurálních tkáních spojených s lézemi nekrózy a zánětu.

tato zpráva dokumentuje případ závažného neurologického onemocnění u mladého dospělého psa s 2týdenním trváním příznaků CNS, kde byl důkaz infekce WNV omezen na mozek. Histologické léze v mozku byly nespecifické, ale kompatibilní s nálezy z WNV encefalitidy hlášených u koní,8 lidí,20 a dvě zprávy u psů,6,18 a to jak s ohledem na umístění (mozkového kmene a míchy) a typu (non-hnisavé encefalitidy s oblastmi nekrózy). Klinické příznaky ztráty rovnováhy (válcování) a ataxie by byly kompatibilní s cerebelomedulárním onemocněním, zatímco třes celého těla naznačuje difúznější narušení mozku. Důkazy o meningoencefalitidy byl nalezen v pyriformní laloku a hipokampu, mozkového kmene a mozečku/prodloužené míše, ale ušetřil hodně z předního mozku. Jaterní nekróza v tomto případě bez důkazu lokální virové replikace (PCR a IHC negativní) byla pravděpodobně způsobena těžkou rekurentní hypertermií. Poškození jater způsobené předchozí replikací viru, které bylo během onemocnění odstraněno, nelze vyloučit, i když nebyl patrný žádný zánět. Četné binukleátové hepatocyty naznačovaly subakutní poškození regenerací. Přítomnost kvasinek Candida v žaludku byla považována za náhodný nález, který lze přičíst léčbě antibiotiky. Na rozdíl od zjištění Buckweitze a kol.6 a Lichtensteiger et al., 18 nebyly zjištěny žádné léze, virové nukleové kyseliny ani virový antigen v žádné extraneurální tkáni, včetně zmrazených a fixovaných ledvin a jater od tohoto psa.

oblast nekrózy nachází v mozkovém kmeni tohoto psa byla spojena s lokalizované makrofágů reakce (gitter buňky), ale není zjevné místní zánětlivé celulizace naznačuje, jak je popsáno u koní,8 léze mohou mít cévní či případně imunitně zprostředkované etiologie, spíše než přímá cytolytická nebo zánětlivé etiologie. IHC pro WNV na mozku nebyl schopen přesvědčivě prokázat virový antigen v tomto případě a v případě hlášeném Buckweitzem et al., 6 indikující nižší úrovně replikace viru než pozorované v ptačích tkáních, opět podobné nálezům u koní.12 Lichtensteiger et al.18 nehlásil IHC mozku.

relativně vyšší míra neurologické onemocnění vidět u koní infekcí s NÁMI kmen WNV ve srovnání s těmi, v Italy8 je podporován experimentální studie na myších, které ukazují, že NÁS kmen je vysoce neuroinvasive ve srovnání s jinými kmeny.3 Další studie na myších prokázaly, že expozice plynných anestetik a CO2 zvýšení WNV neuroinvasion v koncentraci a čase závislé způsobem,4,13 naznačuje, že v oblasti životního prostředí nebo jiných hostitelských faktorů může mít vliv na rozvoj neurologických onemocnění u zvířat. Nízký výskyt klinického onemocnění pozorovaný u psů vzhledem k vysoké séroprevalenci naznačuje, že psi jsou vůči neuroinvazi odolnější než lidé nebo koně.

důkazy o extraneurální infekci nebyly nalezeny u koní s WNV encefalomyelitidou8 jako u tohoto psa. Možná, že v tomto maltském teriérovi imunitní odpověď vyčistila virus z extraneurálních tkání. Přítomnost hojné virové replikace v extraneural tkání v dalších dvou zprávách z NÁS psí infekce naznačuje, že některé virové replikace dochází v extraneural tkání před neuroinvasion a že ledviny a srdce jsou pravděpodobně cílových tkáních u psů. Buckweitz a kol.6 navrhněte renální biopsii pro diagnostiku infekce WNV u psů, ale Lichtensteiger et al.18 nenašel žádný virový antigen v ledvinách psa, kterého vyšetřovali. Klinická hodnota renální biopsie18 nebo dokonce testování moči na WNV, pravděpodobně pomocí RT-PCR, dosud nebyla kriticky hodnocena.

Extraneural replikace WNV na člověka, mohou být extrapolovány ze zprávy o smrtelných encefalitidy u příjemců ledviny od infikovaných dárců, která začala 13-18 dní po transplantaci a od závažné encefalitidy v srdci příjemce,9,11 což znamená, že nemoc může být přenášen prostřednictvím krve nebo transplantace orgánů. Další důkaz robustní replikace WNV v extraneurálních tkáních savců je uveden v nedávné zprávě dokumentující fatální infekci WNV U Tří veverek Východní lišky, s důkazem renální, mozková, srdeční, jaterní, a plicní virová replikace.K objasnění podrobností o biologii a patofyziologii infekcí WNV u savců je zapotřebí 14 dalších studií.

pokračující význam WNV pro zdraví zvířat a lidí v této zemi bude pravděpodobně zahrnovat endemický virus se sporadickými ohnisky. Agentury veřejného zdraví často poskytují včasné informace o propuknutí lidských chorob. Je možné, že analýza protilátek proti WNV u psích a kočičích sér by mohla poskytnout cenné epidemiologické informace o šíření a výskytu WNV.