Otáčení poháněna hydrolýzou ATP

hydrolytické rotační cyklus se skládá ze tří 120 ° stupňů v katalytické F1-domény enzymu, definovanými v biofyzikální rotace pokusy o „katalytické přebývá“ . Každý 120 ° krok je rozdělen do dílčích kroků definován katalytického přebývat po každé 120 ° krok, s intervenující „ATP binding“ přebývat na 30o a „fosfát vydání“ přebývat na 95o. Uvolňování fosfátu umožňuje enzymu dokončit krok 120o a dospět k vazebné prodlevě ATP. Popsali jsme struktur F1-katalytické domény na uvolnění fosfátu a katalytické přebývá, a ukázaly, že 35o rotační sub-kroku mezi fosfát uvolnění a katalytické přebývá závisí na uvolnění fosfátu z „ATP binding“ přebývat, který pak umožňuje enzym přistoupit k „katalytické přebývat“ . Samotné katalytické setrvání představuje přechod, kdy se vázaná molekula ATP připravuje na hydrolýzu. Naše současné úsilí se soustřeďuje na definování katalytického přebývání v encefalopatii F1-Atpáze.

Film Generace 30 ° pootočení γ-podjednotky v encefalopatie F1-Atpázy, a tím uvolnění fosfátu z ßE-podjednotky. Film začíná pohledem ze strany F1-Thiopu v reprezentaci stuhy, s vázaným thiofosfátem jako oranžovými kuličkami. Α-a β-podjednotky jsou červené a žluté. Pak, aTP, aDP, ßTP a ßDP-podjednotky jsou odstraněny postupně opouští aEßE-dimer a centrální stonek podjednotky γ, δ a ε (modrá, purpurová a zelená). Tento zbytkový podkomplex je otočen doprava kolem osy y o 100°, aby se odhalil boční pohled na podjednotku aE a centrální stopku. Poté se odstraní podjednotky δ – a ε a zbytky γ-42-210 a podjednotka ßE se stává slabší. V závěrečné rámy, vázaný fosfát je uvolněn a aE-podjednotky se otevře a přesune se dál od γ-podjednotky, narušuje balení interakce mezi aE – a γ-podjednotek. Za účelem obnovení těchto interakcí se γ-podjednotka otáčí o 30°. Struktura konečného stavu je stav po uvolnění fosfátů bovinní F1-ATPázy nalezený v F1-I3-Thiopu.

Rotace vedený pmf

klíčem chybí vztažný bod pro pochopení generace rotace z pmf je detailní struktura na atomární úrovni dráhy protonů přes membránové domény enzymu. Nejlepší dostupnou strukturou je ta, kterou jsme stanovili v rozlišení 4 Å v roce 2015 rentgenovou krystalografií enzymového komplexu od Paracoccus denitrificans . Další byly stanoveny v letech 2015 a 2016 kryoelektronovou mikroskopií jednotlivých částic bovinních a houbových enzymů, nejlépe při rozlišení 6 Å . Nicméně, tyto modely všechny chybějící detaily potřebné pro formulaci molekulární mechanismus generace rotace z proton-motivní síly, a protože enzymů, pohyblivost a pružnost, jednotlivé částice enzymu může přijmout mnoho různých pozic. Proto představuje neobvykle obtížný problém pro přístup cryo-em.

obrázek membránové domény F-ATPázy z P. angusta. V A-D je podjednotka a-modrá. A A B, pohledy v pevné reprezentaci ze strany a pod membránovou doménou. Na c10-kroužek je šedá, b-podjednotky (horní část není zobrazen) je růžová a světle žluté, cihlově červené, světle azurová a béžové segmenty jsou transmembránové α-šroubovice, Ch1-Ch4 přiřazeny k podjednotky f, ATP8, aH1 a bH1, resp. V c-ring, I-IV označují čtyři transmembránové C-terminální α-šroubovice v kontaktu s podjednotku. C a D, s výhledem na a-podjednotku v pevné a kreslený zastoupení při pohledu z venku a díval se ven z rozhraní s c-kroužek, respektive s aH1 v bledě azurová. Konzervované polární zbytky jsou žluté, pozice lidských mutací spojených s patologiemi (viz tabulka S1) jsou červené. Růžová koule označuje konzervovaný Arg-179 v aH5, který je nezbytný pro translokaci protonů. Dolní šipka označuje vstupní dráhu protonů, které se přenášejí na Glu-59 v C-terminálu α-šroubovice-II c-kroužku. Jsou neseny kolem prstence otáčením proti směru hodinových ručiček při pohledu shora, dokud nedorazí na Arg-179, kde vstoupí do výstupní dráhy označené horní šipkou.

struktury bakteriálních ATP syntáz

obrázek bakteriální ATP syntázy. (A) F1-Atpáza z Caldalkalibacillus thermarum na 2,6 Å rozlišení X-ray krystalografie; (B) ATP syntázy je enzym z bakterie paracoccus denitrificans na 4 Å rozlišení X-ray krystalografie; (C) ATP-syntázy z Escherichia coli na 7 Å rozlišení pomocí kryo-EM.

vzhledem k rozsáhlé studie, které jsme provedli na mitochondriální enzymy, struktury bakteriální ATP synthases byly málo zkoumány, s výjimkou staveb F1 katalytické domény enzymy z bakterie Escherichia coli a Geobacillus stearothermophilus (dříve Bacillus stearothermophilus) v 3.2 a 3.9 Å rozlišení, respektive, a struktury c-kroužky z jejich membránových domén z různých druhů . Ve snaze vyplnit tuto mezeru, tak daleko jsme přispěli strukturu celého enzymu z bakterie paracoccus denitrificans na 4 Å usnesení , a ve spolupráci s Profesorem G. M. Cook a jeho kolegové v Dunedin, Nový Zéland, struktur F1 katalytické domény ATP synthases z Caldalkalibacillus thermarum, Fusobacterium nucleatum a Mycobacterium smegmatis. C. thermarum je thermoalkaliphile a struktury katalytické domény na 2,6 Å rozlišení je nejpřesnější struktury bakteriální F1-Atpáza dosud stanovena . Enzym Z M. smegmatis úzce souvisí s enzymem Z M.tuberculosis. Struktury katalytické domény byla stanovena na 4 Å rozlišení a poskytuje cíl pro vývoj nových anti-tuberkulózní drogy . Oportunní parodontální patogen, Fusobacterium nucleatum, je spojena s celou řadou onemocnění, včetně infekcí ústní, předběžné výsledky těhotenství, gastrointestinální onemocnění a aterosklerózy. Souvisí také s vývojem a progresí kolorektálního karcinomu prostřednictvím inhibice protinádorových imunitních signalizačních drah a následné podpory chemorezistence. To je obligátní anaerobe a páry volnou energii dekarboxylace z glutaconyl-CoA na crotonyl-CoA na transport na+ iontů přes buněčné membrány generovat sodný ion motiv síly (smf). ATP syntáza používá smf k řízení syntézy ATP potřebné pro katabolické a anabolické reakce. Struktura jeho F1-katalytické domény byla stanovena v rozlišení 3,6 Å . Pomocí kryo-EM, mapa neporušené ATP syntázy E. coli byla zveřejněna ukazuje ε-podjednotky v „up“ pozice (viz níže) , a v poslední době, struktura ATP syntázy z Geobacillus stearothermophilus byla stanovena na 3 Å .

struktura ATP syntáz parazitů

obrázek F1-ATPázy z Trypanosoma brucei. Podjednotky α -, β -, γ -, δ -, ε – a p18 jsou červené, žluté, modré, zelené, purpurové a azurové. (A A B) Kreslené reprezentace bočních a horních pohledů; (C-E) povrchové reprezentace (C), bovinní F1-ATPáza, (D), T. lidí enzymu v šedé s p18 odstraněny a barevné úseky vykazující aminokyseliny, a to navíc k bovinní enzym, a (E), T. brucei enzymu s p18 dárek.

struktury a funkce složek ATP synthases, zejména těch, podjednotky přímo zapojeny do katalytické tvorby ATP, jsou široce zachovány v metazoans, houby, eubacteria a chloroplastech rostlin. Na základě mapy ve 32.5 Å rozlišení určuje in situ v mitochondriích euglenozoan parazita Trypanosoma brucei, elektronovou kryo-tomografie, bylo navrženo, že ATP syntázy u tohoto druhu má non-kanonické struktury s různými katalytického místa, kde katalyticky esenciální arginin-prst je k dispozici, není u α-podjednotky přiléhající k katalytického nukleotidové vazebné místo, stejně jako ve všech druhů zkoumány k dnešnímu dni, ale o proteinu, který se nazývá p18 nalézt pouze v euglenozoa . Ve spolupráci s Drs Alena Zíková a Ondřej Gahura z Ústavu Parazitologie v Českých Budějovicích v české Republice, jsme charakterizovali F1-Atpáza z T. brucei a určena krystalová struktura enzymu na 3.2 Å rozlišení . Tato struktura ukazuje, že návrh, že katalytická doména této ATP syntázy má nekanonickou strukturu a různá katalytická místa, je nesprávný. V mnoha ohledech je struktura T. brucei F1-ATPázy velmi podobná struktuře F1-Atpáz stanovených dříve. Na α3β3-sférické část katalytické domény, kde tři katalytická místa se nacházejí, a centrální stonek, jsou vysoce konzervované a arginin prst je poskytována obvykle do α-podjednotky vedle každé ze tří katalytických míst našel v β-podjednotek. Enzym má tedy konvenční katalytický mechanismus. Struktura se liší od předchozí tím, že p18-podjednotky, identifikovány pouze v euglenozoa, spojené s vnější povrch každé ze tří α-podjednotky, čímž rozvíjejí F1-domény. Podjednotka p18 je pentatricopeptide repeat (PPR) protein se třemi PPRs a zdá se, že nemá žádnou funkci v katalytickém mechanismu enzymu. T. brucei je původcem spavé nemoci u člověka a příbuzných onemocnění v domácí zvířata žijící v Sub-Saharské Africe, a struktura jeho F1-ATPases poskytuje cíl pro vývoj nových léků pro léčbu onemocnění.

úloha kardiolipinu

aniontový lipidový kardiolipin je základní složkou aktivních ATP syntáz. V metazoanech obsahují jejich rotory kruh osmi c-podjednotek sestávajících z vnitřních a vnějších kruhů N – A C-terminálních α-šroubovic. Na začátku C-terminální α-helix obsahuje striktně zachovány a plně trimethylated lysin reziduí v lipidové hlavou-skupina regionu membrány. Větší kroužky se známou strukturou, od c9-c15 v eubacteria a chloroplasty, šetřit buď lysin nebo arginin reziduí v rovnocenné pozici. V počítačových simulací hydratované membrány obsahující trimethylated nebo unmethylated skotu c8-kroužky, a bakteriální c10 – nebo c11-kroužky, hlava-skupiny kardiolipin molekuly stal se spojený selektivně s těmito modifikované a nemodifikované lysinových zbytků a s přilehlými polární aminokyseliny, a s druhým zachovány lysinu na opačné straně membrány, vzhledem k tomu, že phosphatidyl lipidy byly přitahovány trochu na těchto stránkách .

obrázek způsoby vazby kardiolipinu na trimethylované C8-kroužky. N-A C-koncové α-šroubovice c-podjednotek jsou tmavé a světle šedé. Molekuly kardiolipinu jsou zelené, s růžovými fosfátovými skupinami. Velké barevné koule představují hrubé zrno korálky pro specifické aminokyseliny, jak bylo uvedeno, leží v 0.7 nm fosfát korálky kardiolipin. Díly a a B, vedoucí skupiny regionu kardiolipin vnitřní informaci vázané na membránu, respektive dvou sousedních c-podjednotek (podjednotky 8 a 1), a jedno c-podjednotky; část C, kardiolipin molekula ve vnějším informaci membrána vázána na jeden c-podjednotky.

Nicméně, na pobytové době kardiolipin molekuly s ringu byly stručné a dostačující pro rotor otočit pouze o zlomek stupně v aktivní enzym. S demethylovaného c8-kruhu a s c10 a c11-kroužky, hustota vázaného kardiolipin molekuly v tomto místě zvýšil, ale bydliště dobách nebyly výrazně změnila. Tyto vysoce specifické, ale krátké interakce s otočnou c-ring jsou v souladu s funkční role pro kardiolipin při stabilizaci a mazání rotoru, a tím interakci s enzymem na vstupu a výstupu z transmembránový protonový kanál, v účasti v protonové translokace přes membránové domény enzymu.

Film Simulace interakce kardiolipin s nativní bovinní c8-kroužek. Protein páteř je zobrazen ve světle šedé barvě, s postranními řetězci Lys-43 (červená), Gln-44 (žlutá), Gln-45 (modrá) a ser-48 (azurová) zobrazeny jako koule. Molekuly kardiolipinu jsou zobrazeny jako zelené tyčinky, s fosfáty jako růžové koule; molekuly POPC a POPE jsou zobrazeny jako tmavě šedé tyčinky s fosfáty jako tmavě šedé koule.