POPIS A OBECNÉ POZNÁMKY

Restriction endonucleases (REs) jsou bakteriální enzymy, které štěpí dvoušroubovici DNA. Res typu I jsou důležité pro bakteriální funkci, ale neštěpí DNA ve specifických sekvencích. REs typu II, popsané pro použití v této příručce, vyžadují vysoce specifická místa pro štěpení DNA, a jsou tedy mimořádně užitečnými nástroji v molekulární biologii. Tyto enzymy umožňují klonování a čištění definovaných fragmentů DNA. 500 nebo tak známé REs jsou obvykle izolovány z různých bakteriálních kmenů.

REs jsou přítomny v bakteriích pravděpodobně zničit DNA ze zahraničních zdrojů (např. infikování bakteriofága) štěpením cizí DNA na specifických rozpoznávacích míst. DNA hostitelských bakterií je chráněna před štěpením, protože specifická rozpoznávací místa jsou modifikována, obvykle methylací na jedné z bází v místě, takže místo již není substrátem pro opětovné štěpení. Prakticky, REs s různými uznání stránky zvláštnosti byly purifikovány z různých bakteriálních kmenů a jsou používány molekulární biologové za definovaných podmínek štěpit čištěná DNA eukaryotické zdrojů do definovaných fragmentů in vitro reakce. Hostitelské bakterie slouží k šíření klonovaných DNA v laboratoři jsou obvykle mutant v hostitelském omezení geny (hsdR, hsdM, nebo obvody hsd); proto je jejich intracelulární enzymové aktivity nebude zničit cizí rekombinantní sekvence.

Tyto konce jsou komplementární („sticky“) a může být enzymaticky znovu připojit, aby se nějaké jiné EcoRI-generované termini pomocí T4 DNA ligázy. Jinými REs rozpoznat různé sekvence a vytvořit unikátní štěpení což v jiných definovanými termini, z nichž některé mají i 5′ vyčnívající konce, 3′ vyčnívající konce, nebo ne vyčnívající (tupý) končí (viz Tabulka 5.1). Každé RE má specifickou sekvenci a počet nukleotidů potřebných k vytvoření rozpoznávacího místa. Některé REs nevyžadují specifický nukleotid v každé poloze rozpoznávacího místa. Například v některých případech postačuje purinový nukleotid (a nebo G) v definované poloze. Frekvence, s jakou bude RE řezat DNA, tedy souvisí s počtem bází v rozpoznávacích sekvencích (pokud je vyžadováno více bází, je vhodné provést méně řezů) a specifickými bázemi v jakékoli poloze.

REs jsou užitečné, protože jejich specifičnost a vyplývající ligatable termini umožňují pitvy, analýzy a restrukturalizace DNA v kontrolovaném, předvídatelné, site-specific způsobem. Protože se jedná o enzymy, každý z nich má specifické požadavky na podmínky vedoucí k optimální štěpné aktivitě. Naštěstí je mnoho aktivních za podobných podmínek, přičemž primární proměnnou je iontová síla (tj. Praktické podmínky byly empiricky definovány pro použití každého RE jako výzkumného nástroje.

množství RE aktivity není obvykle definováno pomocí klasické kinetiky enzymů. Spíše je re aktivita definována prakticky pro použití v laboratoři. Jedna jednotka (U) aktivity pro RE je obvykle definována jako množství enzymu, které sníží 1 µg na všech specifických místech ve vzorku DNA (obvykle bakteriofág λ) za 1 hodinu při 37°C. Skutečná dosažená aktivita se může lišit, pokud jsou přítomna další místa trávení. Například, pokud 1 U z RE je dostatečná, aby řez 1 µg bakteriofága λ DNA zcela na jednom místě v rámci standardních stanovení podmínek, nemusí být schopen zcela řez 1 µg DNA vzorku, které má čtyři místa pro RE, nebo vzorek, který nebyl dostatečně očištěn.

další faktory týkající se reakčních podmínek také ovlivňují RE aktivitu. Patří mezi ně čistota DNA, pufr, teplotní podmínky a samotný RE. Methylace DNA, vázaný protein nebo nadměrná viskozita DNA s vysokou molekulovou hmotností ve viskózních roztocích mohou snížit účinnost opětovného trávení. DNA musí být řez by měl obvykle být bez nečistot; SS-fenol/chloroformové extrakce a etanolové srážení (Část 20-1) odstraní mnoho rušivých nečistot. Naproti tomu většina REs obvykle není nepříznivě ovlivněna RNA nebo jednovláknovou DNA. Přidání tRNA jako koprecipitantu tak může být užitečné při regeneraci malých množství DNA bez ovlivnění následných RE-digestů.

typická podmínka pro RE reakci obsahuje pufr (10 mM Tris, časté je pH 7,4), 10 mM Mg2+ a neobsahuje podstatné koncentrace chelatačních činidel (te pufr obsahuje dostatečně nízké množství EDTA). Re pufry také obsahují správné koncentrace soli, které poskytují optimální iontovou sílu pro každou RE. V některých případech se přidávají BSA, DTT a spermidin, aby se zajistila optimální enzymatická aktivita. Čtyři zobecněné re pufry mohou splňovat požadavky pro většinu REs, a předběžná příprava 10 × zásob těchto pufrů je popsán níže. Většina RE trávení se provádí při 37°C, i když existuje několik výjimek, jako je TaqI.

Většina zakoupené REs jsou dodávány s vhodným skladovacím pufru, ale obsahuje 25-50% glycerolu, aby se zabránilo zamrznutí během skladování při -20°C. Koncentrace glycerolu o více než 5% (obj./obj.) v RE trávení testy mohou inhibovat aktivitu mnoha REs. Kromě toho, vysoká koncentrace glycerolu během RE trávení mohou relaxovat sekvence specificita některých Oze, což vede k falešné výstřihy. Například tento jev je pozorován u běžně používaného re EcoRI, kde rušivá aktivita pozorovaná za určitých podmínek se nazývá aktivita EcoRI* (hvězda). Z těchto důvodů je důležité, aby se objem ZNOVU trávení reakce dostatečně velká, aby zahrnovala alespoň 1:10 ředění ZNOVU sám (a tudíž snížení koncentrace glycerolu). Jiné faktory, jako je pH, ethanol nebo nesprávná koncentrace soli, mohou také způsobit hvězdnou aktivitu nebo sníženou aktivitu; proto je důležité pečlivé dodržování doporučených podmínek.

při použití REs je užitečné několik dalších úvah. při každém přenosu RE použijte nový hrot pipety. Stopové množství kontaminantu přidaného do zásoby RE může zabránit jeho dalšímu použití a zmást výsledky získané v následných experimentech. Při optimalizaci reakcí je lepší přidat další RE než inkubovat mnohem déle než 1 hodinu. kromě toho, jak je uvedeno výše, enzymová aktivita je definována pouze pro řezání dna standardu. Protože vzorek je obvykle zcela odlišný od standardu, dobrým vodítkem je používat cca 2-3 U RE na mikrogram DNA je třeba snížit, a to zejména, když se snaží strávit obtížné vzorku. Někdy může být nutné titrovat množství RE potřebné k vhodnému trávení vzorku DNA.

A konečně, pokud mají být použity dvě REs, je třeba věnovat pozornost optimálním podmínkám soli každého z nich. Pokud oba vyžadují stejný pufr, může být trávení prováděno současně nebo postupně. Pokud jsou vyžadovány různé podmínky soli, musí být nejprve použit RE vyžadující méně soli. Po inkubaci upravte stav soli a strávte s RE vyžadující vysokou sůl. RE aktivita může být odstraněna extrakcí SS-fenolu / chloroformu ve všech případech. Některé REs jsou termolabilní a mohou být inaktivovány zahříváním na 70°C po dobu 5 minut. Tato vlastnost se však liší od jednoho RE k druhému a měla by být ověřena pro každý znovu použit.